高效液相色谱法同时检测叶面肥料中4种植物生长调节剂的研究*

Study of Determination of Four Plant Growth Regulators in Foliar Fertilizers Simultaneously with High Performance Liquid Chromatography

杨一 Yi Yang , 张娟 Juan Zhang , 朱海荣 Hairong Zhu

1 上海化工研究院上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Shanghai 200062 2 山东省产品质量检验研究院山东济南 250100 Shandong Institute for Product Quality Inspection Shandong Jinan 250100

Author notes:

Correspondence to: 张娟(1976-)，女，高级工程师，主要从事肥料、农药等产品质量检测及标准科研研发工作；ruyue95@163.com

摘要：

通过试验，建立了同时测定叶面肥料中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸4种植物生长调节剂的高效液相色谱分析方法。试验结果表明：在样品采用甲醇提取、以甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相、采用梯度洗脱、进样量10 μL、柱温35 ℃的条件下，测试样品的测定结果在1.0~100.0 mg/L范围内线性关系良好，检出限为0.1 mg/L；在0.05%，0.50%和5.00%添加水平上，方法的平均回收率在90.0%~105.0%之间，相对标准偏差(RSD)＜5%(n＝6)；该方法通用性强、选择性好、灵敏度高，可满足叶面肥料中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸4种植物生长调节剂同时检测的要求。

关键词：

高效液相色谱法; 叶面肥料; 氯吡脲; 烯效唑; 萘乙酸; 脱落酸;

Abstract：

Through experiment, an analysis method for determination of forchlorfenuron, uniconazole, naphthylacetic acid and abscisic acid in foliar fertilizers at the same time with high performance liquid chromatography is established. Experimental results show that under conditions that samples are extracted with methanol, methanol and 0.1% formic acid aqueous solution are used as mobile phase, gradient elution is used, the injection volume of the sample is 10 μL and column temperature is 35 ℃, in the range of 1.0~100.0 mg/L of sample tested, the method has a good linear relation, the limit of determination is 0.1 mg/L; at concentration levels of 0.05%, 0.50% and 5.00%, the mean recoveries are between 90.0% and 105.0% with relative standard deviations less than 5% (n＝6). This method has the characteristics of high universality, good selectivity and high sensitivity, it can meet the requirements of determination of four plant growth regulators, forchlorfenuron, uniconazole, naphthylacetic acid and abscisic acid, in foliar fertilizers at the same time.

Keyword：

high performance liquid chromatography; foliar fertilizer; forchlorfenuron; uniconazole; naphthylacetic acid; abscisic acid;

氯吡脲、萘乙酸、脱落酸和烯效唑是国内外广泛使用的4种植物生长调节剂，其中：氯吡脲对植物生长起促进作用，广泛应用于猕猴桃、葡萄、苹果、黄瓜等作物上^[1]；萘乙酸可以增加坐果、防止落果和改变雌雄花比率^[2]；脱落酸可以抑制种子提前萌发、诱导休眠，用于种子的储藏^[3]；烯效唑作为植物生长延缓剂，广泛应用于果树、烟草和花卉等植物^[4]。随着施肥技术的发展，近年来叶面施肥已成为强化作物吸收营养和防止发生某些缺素症状的有效措施，但在叶面肥生产、销售过程中非法添加农药(包括植物生长调节剂)的现状，使农业生产安全存在重大隐患^[5]，建立肥料中这些物质的检测方法尤为迫切。

氯吡脲和烯效唑含量的检测多采用高效液相色谱(HPLC)法^[6-12]，萘乙酸的检测可采用化学法、气相色谱法和液相色谱法^[13-16]，而HPLC法和放射免疫法常被用于检测脱落酸^[17-18]。目前，对多种组分的同时检测技术研究较少，且存在样品前处理过程复杂、溶剂消耗多、分析时间长等问题；另外，关于植物生长调节剂的检测通常见于蔬菜、水果中的残留分析，对叶面肥料中的植物生长调节剂的检测研究报道甚少。本试验采用高效液相色谱技术建立了对叶面肥中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸4种植物生长调节剂同时定量检测的方法，弥补了叶面肥中植物生长调节剂检测方法的空白。本试验的主要技术优势：以甲醇-甲酸水溶液为流动相，易于配制；以甲醇作为提取剂，样品前处理方法简单、快捷。通过试验，氯吡脲、烯效唑、萘乙酸及脱落酸4种待测物含量在1.0~100.0 mg/L范围内线性相关系数在0.999以上，最低检出限为0.1 mg/L，检测方法具有通用性强、选择性好、灵敏度高、可操作性强的优势，完全能够满足叶面肥料中4种植物生长调节剂的同时测定。

1 试验部分

1.1 主要仪器和试剂

Waters e2695高效液相色谱仪、二极管阵列(PDA)检测器、Empower数据处理系统(美国Waters公司)，Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)，Sigma 3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，电子天平(瑞士Sartorius公司)，SIR漩涡混合器(德国IKA公司)。

氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，相应标准品化学结构、CAS号、分子式和相对分子质量等见图 1；甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，其余试剂均为分析纯(北京化工厂)；水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

图 1

4种化合物的CAS号、分子式、相对分子质量

1.2 液相色谱条件

所选用的色谱柱为Symmetry Shield RP18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相为甲醇(简称A)和质量分数0.1%甲酸水溶液(简称B)；色谱分离采用梯度洗脱程序，即0.0~7.0 min为30%~45%A，7.0~13.0 min为45%~55%A，13.0~18.0 min为55%~80%A，18.0~26.0 min为80%~90%A，26.0~26.1 min为90%~30%A，26.1~33.0 min为30%A；流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.3 样品前处理

固体样品：称取2.0 g(精确至0.001 g)已粉碎样品置于50 mL比色管中，加入20 mL甲醇，涡旋振荡3 min至样品完全溶解，以8 000 r/min离心分离10 min，移取1 mL上清液至10 mL容量瓶中并定容至刻度，取定容后的溶液过0.45 μm有机相滤膜，待测。

液体样品：直接称取样品2.0 g(精确至0.001 g)，处理方法同固体样品。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

按照试验方法分别对4种化合物的标准溶液(50 mg /L)在190~490 nm范围内进行全波段扫描，分析所得光谱图和液相色谱图得知，氯吡脲最大吸收波长为262 nm，烯效唑最大吸收波长为254 nm，萘乙酸最大吸收波长为280 nm，脱落酸最大吸收波长为245 nm。为简化操作或提高紫外检测器的适用性，选择氯吡脲、烯效唑和脱落酸最佳同时检测波长为250 nm，萘乙酸最佳检测波长为280 nm。

2.2 提取溶剂的选择

在同一样品(经测定不含氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸)中添加适量氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脱落酸混合标样溶液，混合后用氮气流缓慢吹干，然后分别以甲醇、30%(质量分数，下同)甲醇-水、30%甲醇-0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂，比较不同提取溶剂的提取效率。结果表明，甲醇的提取效率最高，相应的回收率以及精密度见表 1。4种化合物在甲醇中的溶解度较高，可以保证较好的提取效果，故选择甲醇作为提取溶剂。

表 1

4种化合物的回收率和精密度试验结果(n=6)

提取溶剂	待测物	加入量/%	回收率/%	相对标准偏差(RSD)/%
甲醇	氯吡脲	0.5	94.39	1.45
	烯效唑	0.5	97.71	1.59
	萘乙酸	0.5	104.40	1.43
	脱落酸	0.5	92.21	3.37
30%甲醇-水	氯吡脲	0.5	75.26	3.28
	烯效唑	0.5	79.15	1.65
	萘乙酸	0.5	81.56	2.57
	脱落酸	0.5	76.22	3.41
30%甲醇-0.1%甲酸水溶液	氯吡脲	0.5	75.56	3.28
	烯效唑	0.5	78.13	2.91
	萘乙酸	0.5	79.29	2.67
	脱落酸	0.5	74.24	3.55

2.3 流动相的选择

4种待测物的醇溶性均较好，在RP18色谱柱上的保留行为合适。本试验选择Waters公司粒径为5 μm的Symmetry Shield RP18柱(250 mm×4.6 mm)为色谱分离柱，比较了甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液最优条件液相色谱图，结果如图 2~图 4所示。

图 2

以甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相时的液相色谱图

图 3

以甲醇-水为流动相时的液相色谱图

图 4

以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时的液相色谱图

以甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相时，脱落酸(保留时间t_R=18.897 min)和萘乙酸(t_R=20.483 min)的峰形较差；以甲醇-水为流动相时，4种化合物基本可以实现分离，但峰有拖尾现象(脱落酸t_R=15.507 min，萘乙酸t_R=19.455 min，氯吡脲t_R=21.059 min，烯效唑t_R=22.885 min)；最终发现，在RP18键合固定相上分离试样中的化合物，选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，4种化合物可以实现有效分离，各化合物保留时间适中、峰形良好，在250 nm波长下的保留时间分别为脱落酸7.706 min、萘乙酸10.582 min、氯吡脲19.310 min和烯效唑22.566 min。

2.4 线性范围和方法定量限

在本方法所确定的色谱条件和待测物含量1.0~100.0 mg/L范围内，对4种化合物的混合标液按质量浓度从低到高进样分析测定，4种化合物测定结果的线性范围、线性回归方程、相关系数和定量限见表 2。采用在空白样品中添加目标化合物的方法，也可以得到相近的线性范围和定量限。试验结果表明，该方法测定4种化合物的检出限为0.1 mg/L，定量范围为1.0~100.0 mg/L，测定范围宽，色谱分离效果好。

表 2

4种化合物测定结果的线性范围、线性回归方程、相关系数和定量限

待测物	线性范围/(mg·L^-1)	线性回归方程	相关系数	检出限/(mg·L^-1)
氯吡脲	1.0~100.0	Y=6.38×10⁴X-4.62×10⁴	0.999 9	0.1
烯效唑	1.0~100.0	Y=3.17×10⁴X-2.42×10⁴	0.999 8	0.1
萘乙酸	1.0~100.0	Y=2.15×10⁴X-1.69×10⁴	0.999 9	0.1
脱落酸	1.0~100.0	Y=4.59×10⁴X-3.59×10⁴	0.999 9	0.1

2.5 方法回收率和精密度

在空白样品中添加标准溶液进行加标回收率试验，取6个平行样，按本方法进行提取处理并分析测定，计算添加回收率和精密度，试验结果如表 3所示。

表 3

肥料中4种化合物的回收率和精密度试验结果(n=6)

待测物	加入量/%	回收率/%	相对标准偏差(RSD)/%
氯吡脲	0.05，0.50，5.00	90.31，94.39，86.45	0.85，1.45，3.15
烯效唑	0.05，0.50，5.00	94.36，97.71，90.24	0.98，1.59，2.56
萘乙酸	0.05，0.50，5.00	89.45，104.40，92.38	2.67，1.43，3.09
脱落酸	0.05，0.50，5.00	89.20，92.21，96.35	2.46，3.37，3.21

由表 3可知，平均回收率在90.0%~105.0%，相对标准偏差(RSD)在0.85%~3.37%，表明本方法可满足检测要求，具有良好的重复性和再现性。

2.6 实际样品检测

选取30批次市售叶面肥样品依次编号，按本方法进行提取处理并分析测定，测定结果如表 4所示。

表 4

实际样品检测结果

样品编号	w(氯吡脲)/%	w(烯效唑)/%	w(萘乙酸)/%	w(脱落酸)/%
1	0.00	0.00	0.00	0.65
3	0.28	0.00	0.00	0.00
6	0.00	0.00	2.89	0.00
7	0.00	0.00	0.00	0.86
9	0.00	0.58	0.00	0.00
10	0.00	0.00	1.56	0.00
16	0.00	0.78	0.00	0.00

由表 4检测结果可知，7个批次的液体肥料样品中含有植物生长调节剂，其中1号和7号含有脱落酸，6号和10号含有萘乙酸，3号含有氯吡脲，9号和16号含有烯效唑。

3 结语

通过试验所建立的高效液相色谱法适用于同时检测叶面肥中的脱落酸、萘乙酸、氯吡脲以及烯效唑含量，检出限为0.1 mg/L，定量范围为1.0~100.0 mg/L，测定范围宽，色谱分离效果好；在试验确定的色谱条件下，33 min内即能实现待测物的有效分离，基质干扰小；样品测定结果的相对标准偏差、加标回收率表明该测定方法具有良好的重复性和再现性，同时具有较高的回收率，定量准确，完全可以用于同时检测叶面肥中的脱落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑含量。

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