供试黄瓜：品种为天津新四号，购自东亚种子公司，选择籽粒饱满、大小和色泽一致的种子进行试验。

供试土壤：采自内蒙古赤峰市，为草原盐碱土，采样深度0~3 m，过150 μm(100目)筛，其含水质量分数为8.0%，pH为6.13，经检测含有少量土霉素残留(38.6 μg/kg)。

供试土霉素废渣：由内蒙古格林特制药有限公司提供，含土霉素约4 000 mg/kg；降解后的土霉素废渣含土霉素约10 mg/kg，由上海化工研究院化肥所提供。

供试土霉素碱溶液：由内蒙古格林特制药有限公司提供，纯度95%(质量分数)以上。

10 000 mg/kg土霉素储备液：将1 g土霉素碱溶液溶于500 mL Tris-HCl溶液(pH=7)中，然后用铝箔包裹并置于冰箱中保存，使用时需将其pH调节至6~7才能进行后续试验。

水培试验：在Φ9 cm的玻璃培养皿中铺一层滤纸，将消毒后的20粒黄瓜种子均匀地置于培养皿中，然后加入不同浓度的10 mL土霉素碱溶液，其中土霉素最高浓度为4 000 mg/kg(全部试验均采用同一水平梯度浓度)，置于25 ℃人工气候箱中培养20 d；对照中加入10 mL去离子水；所有处理3次重复。对照种子发芽率大于90%、胚芽和胚根长度＞2 mm时，认为是种子正常发芽；当对照根长达20 mm时，培养结束，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高平均值及标准偏差。

土培试验：称取300 g土壤于塑料培养盒中，将不同浓度土霉素碱溶液均匀地喷洒于土壤表层(对照喷洒去离子水)后混合搅拌均匀染毒，调节土壤含水质量分数至约25%，每个处理播20粒种子，置于25 ℃人工气候箱中培养20 d，每个处理进行3次重复。当培养种子达到正常发芽标准时，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高等指标。

称取150 g土壤于塑料培养盒中，将不同浓度的土霉素废渣与土壤按质量比1 :1混合搅拌均匀染毒，对照不加入废渣，然后放置24 h老化，在与上述试验相同温度条件下进行种子的培养试验，每个处理播20粒种子并进行3次重复。培养20 d后，当培养种子达到正常发芽标准时，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高等指标。

采用Excel 2010计算3次重复所得数据的平均值及标准偏差，对数据进行单因素方差分析，差异显著性水平为p＜0.05。

第1阶段(无论是土霉素废渣还是土霉素碱溶液中土霉素浓度范围500~4 000 mg/kg)的毒性试验结果表明，土霉素废渣和土霉素碱溶液加入土壤中，抑制黄瓜种子发芽的土霉素浓度极限值均在4 000 mg/kg左右，而土霉素碱溶液加入水中影响黄瓜种子发芽的极限值在500 mg/kg左右。为此，第2阶段的试验缩小土霉素浓度范围，在0~500 mg/kg内以几何级数为间隔进行，从而确定促进黄瓜种子发芽的最佳土霉素剂量。

本试验体系中含有土霉素碱溶液和土霉素废渣，为使所测结果能较客观地反映黄瓜种子发芽生长，必须采用水培和土培试验进行对照。

在土霉素浓度0~4 000 mg/kg范围内进行的试验表明：①土霉素是一种重要的植物激素，能促进种子和其他休眠器官的萌发，促进代谢反应，刺激植物生长，但与其浓度密切相关。从试验结果得知，无论是单一土霉素碱溶液还是土霉素废渣+土壤混合物，剂量范围在25~50 mg/kg时，对黄瓜种子发芽率、幼芽早期生长发育均有显著的促进作用。②土霉素碱溶液添加至土壤和水中，使得植物种子发芽率与对照相比也存在差异，水培对种子发芽率的影响远大于土培。不同浓度土霉素对黄瓜种子发芽率的影响如图 1所示。

图 1

不同浓度土霉素对黄瓜种子发芽率的影响

试验表明，土霉素各处理都能不同程度地提高黄瓜种子发芽率，但发芽率均存在差异。由图 1可知：土霉素碱溶液和土霉素废渣分别加入土壤，以上2种处理的对照组的土霉素浓度为0 mg/kg，其发芽率分别为86.3%和38.3%；在土霉素浓度为25 mg/kg时，发芽率均达到最高点，分别为100.0%和76.7%，其中低浓度土霉素废渣对黄瓜种子发芽率的提高最为显著，提高38.4%；继续升高土霉素浓度，发芽率不断下降，但仍高于对照；当废渣的土霉素剂量超过100 mg/kg后，对黄瓜种子发芽产生显著影响，与对照相比，几乎无法发芽。

不同浓度土霉素碱溶液在水中抑制种子发芽的作用均大于在土壤中，且土霉素浓度越高抑制作用越明显。种子在土霉素碱溶液+水中培养，纯水(对照)中种子发芽率保持100%，随着土霉素碱溶液浓度不断提高，当达500 mg/kg时，种子发芽率明显下降；水中土霉素污染水平高于750 mg/kg时，种子几乎不能发芽，而土壤中土霉素碱溶液污染水平直至4 000 mg/kg仍能发芽。

试验表明，3个处理的土霉素污染对黄瓜株高和生物量的影响有较大差异，其中土霉素碱溶液+土壤的影响最为明显，如图 2所示。

图 2

不同浓度土霉素对黄瓜株高和生物量的影响

由图 2可知：与土霉素浓度为0 mg/kg(对照)相比，在土霉素碱溶液中的土霉素浓度为25 mg/kg的土壤上生长的黄瓜株高和生物量分别提高了13.7%和3.1%；在相同的污染水平下，土霉素碱溶液+水和土霉素废渣+土壤的黄瓜株高则分别比对照下降了83.7%和50.5%，生物量也分别比对照下降了58.9%和33.3%；当土霉素碱溶液中土霉素剂量达到50 mg/kg时，土霉素碱溶液+水处理的株高和生物量与25 mg/kg水平相比提高了62.5%和28.0%，土霉素废渣处理的株高和生物量提高了16.1%和9.5%；随着土霉素污染水平的继续提高，3个处理的株高和生物量均呈现下降趋势。试验结果表明：无论在何种环境中，种子生长前期对土壤抗生素的污染抵抗能力较弱，土霉素溶液会直接对种子发芽造成影响，使得株高和生物量一直低于对照；土霉素碱溶液加入土壤中的影响小于其他2个处理。

种子发芽试验和早期幼芽生长发育试验是毒理学常用的试验方法，具有快速、便捷等优点，被众多的学者用作研究污染胁迫下的植物发芽、生长以及芽长等指标以综合评价该污染物的毒性^[7-8]。本试验研究发现，土霉素废渣或土霉素碱溶液中的土霉素浓度＜25 mg/kg时，黄瓜种子发芽率与对照相比均无显著差异。一方面是由于抗生素等新型污染物的毒性不如工业化学品那样剧烈，另一方面种皮对种子的保护作用不可忽略，抗生素很可能被吸附在种皮上而并不会对种子根部的生长发育产生剧烈影响，即种皮起到阻挡种子胚芽与外界环境直接接触的作用，使胚芽免受污染物的直接侵害^[9]。值得注意的是，目前确定的种子发芽标准是胚根从种孔中突破种皮，向下生长形成主根，但这种生长并不一定是由细胞分裂产生的，而可能仅是简单的细胞生长^[10]。这就意味着虽然从表面上看种子正常发芽伸出，但并不能说明污染物的胁迫对它们体内的细胞没有毒性效应。随着抗生素浓度的增加(土霉素浓度≥100 mg/kg)，抗生素对种子发芽率产生了显著的抑制作用，说明此时抗生素已对种子的萌发产生毒性效应。

黄瓜的芽生长抑制率随抗生素浓度的增加呈上升趋势。浓度相同时，土霉素碱溶液在土壤中对黄瓜芽生长抑制效应明显低于在水溶液中，表明土壤介质对抗生素污染有缓冲作用。其原因与此类抗生素被土壤吸附且不易解吸有关，从而降低了其生物有效性和向土壤水溶液中的释放。

试验结果表明：土霉素浓度在25~50 mg/kg时，对黄瓜发芽生长具有显著的促进作用，这是由于低浓度的抗生素对植物生长具有一定的促进作用^[11]；但当抗生素浓度超出黄瓜种子所能耐受的范围，黄瓜的芽生长又逐渐出现抑制效应。

在土培条件下，土霉素碱溶液处理的黄瓜幼芽生长和生物量均高于废渣处理，表明废渣对植物的缓冲强度高于土霉素碱溶液。其原因可能是土霉素废渣内残留的微量土霉素和降解物施入土壤后，导致幼芽生长受阻；也可能是污染物抑制了土壤中微生物的活性，使土壤中营养物质转化受阻，影响作物根系对营养物质的吸收，导致作物根尖细胞有丝分裂数明显减少，分裂速度减慢，从而导致幼芽生长受抑制。因此，很容易理解土霉素废渣+土壤最能影响种子发芽，而且说明土霉素废渣+土壤复合体有其特殊性，不是这两者简单的加和作用。研究发现，所用土壤对土霉素的生物有效性具有较强的降低作用，但有待于结合其在土壤中的吸附、解吸、生物有效性、形态分析等作出进一步解释。