Screening of New Microbial Functional Bacterial Agents and Development of Functional Bacterial Fertilizer
Abstract：
In view of the shortcomings of traditional microbial fertilizers, three functional strains with unique functions and obvious effects, namely, phosphorus-solubilizing microorganisms FL7, potassium bacteria K3 and azotobacter N1 were screened out and the compound microbial agent was prepared. The compound microbial functional bacterial fertilizer was prepared by adding the compound microbial agent to livestock and poultry manure in a certain proportion. The field experiments showed that the compound microbial functional bacterial fertilizer had the characteristics of improving the rhizosphere micro-ecological environment of crops, increasing the quality of crops, improving the soil and lowering the production cost.
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前言
微生物肥料是指一类含有活性微生物的特定制品剂，应用于农业生产中能获得特定的肥料效应[1]。在这种效应的产生过程中，具有活性的微生物发挥着关键作用。
微生物肥料施入土壤后，利用微生物的生命活动，将空气、土壤中的惰性元素转化为作物可直接吸收的离子态元素；将土壤中难溶的无机物活化变成可溶性的无机物，以增加土壤中有效氮、磷、钾的含量，同时将作物不能从土壤中直接利用的物质转化成可被吸收利用的物质，制造和协助农作物吸收营养，改善作物营养条件，抑制病原菌的活动，增强作物抗病和抗旱能力。在微生物的活动中，可使土壤有机质转化形成腐殖质，形成新的土壤团粒结构，提高土壤肥力，改善土壤理化性状，增强土壤保肥、保水能力，进而提高作物的产量和品质。
生物有机肥质量的优劣主要取决于菌种以及生物肥料中有益微生物的活菌数和作用强度[1]。我国地域广阔，农业生产基础差，多种地理与自然、生态环境差异较大，多数地区受干旱、土壤理化性状等因素的影响，微生物肥料在施入土壤后导致生物菌群减少，效果不明显，所以选育抗不良环境且适应性优良、耐温、耐干旱、耐盐碱的菌种，保证肥料中应有的活菌数是生物有机肥料生产的关键。
大多数含微生物有机肥是以有机物为载体，吸附微生物菌剂后再与有机、无机化肥混合而成的产品。常用微生物菌株不耐高温和盐碱，一般生长温度在20~40 ℃，温度达到60 ℃以上时80%的微生物将死亡，温度越高，微生物死亡的速度越快，且pH＜6或pH＞8都很难存活。因此，选育抗干旱、耐温、耐盐碱的有效菌株十分重要。有鉴于此，在生物有机肥的生产过程中加入菌剂后，载体温度应控制在50 ℃以下[2]。
目前，市场上销售的微生物菌肥多为单一菌种，导致其功能和作用单一，若要实现复合功能，必须同时或分步加入不同性能的功能菌肥，使生产成本增加，而且各菌种之间的相互吞噬会抵消某一功能菌种的作用。由于根际有益微生物与作物间有较强的选择性，对环境条件也有一定的要求，所以筛选、复配复合功能菌种并达到相互共生、共存，实现各类菌剂复合的系列产品，才能满足不同地区不同作物的需求[3]。
自20世纪80年代以来，无机元素肥料的持续投入已造成我国多数地区土壤无机盐的富集，如无机态氮在土壤中占全氮质量分数最高已达40%。
鉴于上述问题，就重点解决微生物菌群耐受性差、微生物菌肥菌种和功能单一、有效活菌种类少、菌肥综合效果不佳等问题开展了试验研究。
1
菌种筛选与工艺设计
首先筛选出多种具有自主知识产权，作用机理明确，高耐受性，拥有解磷、解钾、固氮等功能的菌株[7]并采用菌剂扩繁系统进行菌剂扩繁、复配，然后采用牛粪、猪粪、羊粪等作为基质进行高温堆肥发酵，再经翻抛、熟化、降温、筛分等工艺程序，制备出适用于多种不同土壤的复合微生物功能菌肥。
1.1
菌种的筛选
通过土壤微生物、粪污发酵微生物培养筛选各种功能菌株，经优选比对，最终选定了3个功能独特、效果明显的功能菌株，即解磷菌FL7、解钾菌K3、固氮菌N1，其主要特性如下。
(1) 解磷菌FL7
解磷菌FL7为解磷酵母菌(粉状毕赤酵母)，解磷量达436.63 μg/mL，可在45 ℃、质量分数23%氯化钠、6 mol/L铵离子、pH为9等条件下生长，是一类能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态的微生物。除了可以活化土壤中难溶性磷外，解磷菌FL7还可以通过影响植物根系分泌物的种类和数量以增加植物对周围营养元素的吸收，使植物能适应缺磷的环境。
(2) 解钾菌K3
解钾菌K3(芽孢杆菌)解钾量达4.10 mg/L，可在55 ℃、质量分数14%氯化钠、1.2 mol/L铵离子、pH为5~9等条件下生长。
(3) 固氮菌N1
所选用的固氮菌N1(圆褐固氮菌)的固氮量为0.018 1 mol/L，可在50 ℃、质量分数11%氯化钠、0.8 mol/L铵离子、pH为4~10等条件下生长。
由此可见，3个菌株对高温、高盐浓度、高铵离子浓度、偏碱性环境等生长条件具有良好的耐受性能。
1.2
菌剂的扩繁工艺流程
1.2.1
无菌水制备
采用无菌水设备制备无菌水，然后贮存于无菌水储罐。
1.2.2
各种功能菌剂的制备
各种功能菌剂的主要制备流程：种子解冻发酵→摇瓶培养→一、二级种子罐培养→发酵罐发酵→发酵液储罐贮存。各种功能菌剂制备的具体步骤如下。
(1) 首先将冷冻保藏管中的菌种在恒温箱中于35~37 ℃下活化22~26 h；然后制备培养基，将培养基用酸碱调节剂调整至菌种所需的pH范围内；在平板上进行接种后，在恒温箱中于35~37 ℃下纯化22~26 h，最终得到平面菌种或菌种平面。
(2) 摇瓶培养阶段：①取一环纯化后的的菌种，接入装有20 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，然后置于恒温箱中于35~37 ℃下利用频率180次/min摇床摇动培养3~5 h，然后静置培养19~21 h；②将上述种子液分成5等份，接入5个盛有20 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，再次置于恒温箱中，于35~37 ℃下用频率180次/min摇床摇动培养22~26 h，然后向一级种子罐接种。摇瓶接种前，用酸碱调节剂将培养基调整至各菌种所需的pH范围内。
(3) 种子罐发酵阶段：由摇瓶菌种向一级种子罐的接种量控制在一级种子罐实际装料量的5.0%，pH控制在各菌种所需的范围内，发酵温度控制在25~35 ℃，总装料量控制在种子罐容积的60%~70%，搅拌转速控制90 r/min或180 r/min(变频搅拌，变频调整频率时间为10 min)。二级种子罐的具体工艺操作和参数控制与一级种子罐大体相同。
(4) 发酵罐发酵阶段。发酵罐主要部件包括罐体、搅拌器、联轴器、轴承、轴封、挡板、空气分布器、换热装置、传动装置、消泡器、人孔试镜、管路等。发酵罐装液量为罐体容积的60%~75%，最佳接种量为实际装液量的1%~5%(依据不同菌种的繁殖速度进行合理接种)。发酵温度控制在25~35 ℃，pH控制在各菌种所需的适宜范围内。搅拌转速按100 r/min或200 r/min变频进行，转速过快会对菌丝体产生破坏，转速过慢易产生发酵泡沫，而且会因为溶解氧不足而影响微生物的生长繁殖。发酵时间和发酵终点的确定通过镜检观察微生物菌体的形态、密度以及芽孢形成率最终确定，一般芽孢形成率达到≥80%时即可界定发酵完成，然后导入发酵液储罐备用。
1.2.3
混料
固氮菌N1、解磷菌FL7和解钾菌K3以一定的质量比计量后在混料机进行混料，最终得到相应比例的复合微生物菌剂。
1.2.4
菌剂的添加
完成复合微生物菌剂的制备之后，按质量比1 :250 000添加于来自养殖场的畜禽粪便中。考虑到该菌肥加菌工艺的需要，若直接在发酵槽内喷淋会有菌种混合不均、局部物料发酵不理想等问题，故采用直接在混料阶段加入功能菌剂至所需的比例。
1.3
微生物菌肥的发酵处理
利用发酵槽进行微生物菌肥的发酵处理，其优点是占地面积小、发酵升温快且均匀、便于机械化作业。单槽尺寸75.0 m×(4.0~6.0) m×1.8 m，物料堆高为1.5 m，单次翻堆距离3.0~5.0 m，物料发酵时间14 d左右。每只发酵槽配置1台槽式翻堆机、1间风机房，分段曝气，根据物料供氧需要控制鼓风量。发酵槽内设曝气和抽气装置，发酵车间整体封闭，车间内合理分布配置臭气收集口，将发酵过程中产生的臭气收集至除臭系统进行处理。当料堆温度达到70 ℃时，用翻堆机将物料进行翻堆，每次翻堆物料向后移动3.0~5.0 m。
1.4
出料及产品加工
经过14 d左右好氧发酵形成的含有复合微生物菌群的微生物有机肥原料采用装载机直接出料至自然腐熟场，经自然堆放(一般150~200 m3堆成1个条形堆，堆高3~4 m，底宽4~5 m)45 d左右完成第2次自然腐熟后，用筛分机筛分，最终得到合格的复合微生物功能菌肥产品，其w(N+P2O5+K2O)≥5%，功能菌总数≥0.2亿个/g。若需进行造粒，则送至造粒机造粒。
2
功能菌剂的活性特征及菌肥的施用效果
2.1
功能菌剂的活性特征
采用该方法制备的复合微生物菌剂的活性组分：w(固氮菌N1)为50%，w(解磷菌FL7)为30%~35%，w(解钾菌K3)为15%~20%。经检验，每个菌种在该复合菌剂中的有效活菌数为：固氮菌N1总菌落数＞20亿个/g，解磷菌FL7总菌落数＞2亿个/g，解钾菌K3总菌落数＞25亿个/g，菌体总量＞47亿个/g。按质量比1 :250 000向畜禽粪便中添加后得到的复合微生物功能菌肥的菌体总量＞0.2亿个/g，达到或超过国家标准《生物有机肥》(NY 884—2012)规定的要求。
研发成功的解磷、解钾、固氮复合微生物功能菌肥主要适合各种粮食作物、经济作物、果树等，特别适合各种瓜菜等经济作物。因其含有特殊的功能菌群，能在改善土壤微生物环境的同时，杀灭各种致病菌(如真菌、细菌等)，减少作物的发病率，进而提高作物产量和品质。
2.2
应用效果
2.2.1
在黄瓜上的应用效果
2016年在玉田县玉田镇梁各庄村进行黄瓜施用复合微生物功能菌肥试验，复合微生物功能菌肥施用量2 250 kg/hm2，中期不追肥；对照施用复合肥(N-P2O5-K2O为15-15-15)1 200 kg/hm2，中期追肥2次，每次追施尿素225 kg/hm2。
生长期观察：对照处理生长正常；施用复合微生物功能菌肥的处理出苗整齐健壮，茎蔓粗壮，叶片肥厚，座果率高，无病虫害，瓜条直，瓜形和口感好。
产量比较：施复合微生物功能菌肥的黄瓜产量100 770 kg/hm2，比对照处理(79 470 kg/hm2)增产21 300 kg/hm2，增产率达到26.8%。
病害调查：施用复合微生物功能菌肥的处理病株率极低，仅0.62%，并且没有重病株，病株率比对照处理减少7.88%，这也是增产的原因之一。
2.2.2
在棉花上的应用效果
2016年在玉田县陈家铺乡进行棉花施用复合微生物功能菌肥试验，复合微生物功能菌肥施用量2 250 kg/hm2，蕾期追施尿素225 kg/hm2；对照施用复合肥(N-P2O5-K2O为15-15-15)900 kg/hm2，蕾期追施尿素225 kg/hm2。
生长期观察：对照处理生长正常；施用复合微生物功能菌肥的处理出苗整齐健壮，植株稳健，叶片浓绿，单株结铃数和单铃质量都有增加。
产量比较：施用复合微生物功能菌肥的棉花产量9 135 kg/hm2，比对照处理(7 695 kg/hm2)增产1 440 kg/hm2，增产率18.7%。
2.2.3
对玉米产量和品质的影响
2017年在玉田县亮甲店镇孔五官屯村进行了玉米施用复合微生物功能菌肥的试验，复合微生物功能菌肥施用量2 250 kg/hm2；对照施用N、P2O5、K2O的量分别为300、150、240 kg/hm2；全部肥料的2/3作为底肥施入，剩余的1/3作为追肥在大喇叭口期穴施。田间管理、浇水等按常规进行，不同处理对玉米产量和品质的影响如表 1所示。
表 1
|
处理 |
百粒重/g |
百粒重增幅/% |
产量/(kg·hm-2) |
增产率/% |
w(赖氨酸)/% |
赖氨酸增幅/% |
w(蛋白质)/% |
蛋白质增幅/% |
w(脂肪)/% |
脂肪增幅/% |
|
对照 |
28.64 |
|
6 120 |
|
0.425 |
|
10.58 |
|
4.31 |
|
|
试验组 |
31.72 |
10.75 |
6 936 |
13.33 |
0.463 |
8.94 |
11.49 |
8.60 |
4.97 |
15.31 |
由表 1可以看出，施用复合微生物功能菌肥的处理虽然减少了N、P2O5和K2O的用量，但产量提高了13.33%，同时玉米的品质也有较大程度的提高，特别是赖氨酸含量增加了8.94%，蛋白质和脂肪的含量也有不同程度的提高，对主要用于饲料的高赖氨酸玉米有重要的品质提高作用。
2.2.4
在大白菜上的应用效果
2017年在河北省玉田县亮甲店镇何庄子村进行了大白菜施用复合微生物功能菌肥的试验，底施复合微生物功能菌肥2 250 kg/hm2；对照处理底施枯草芽孢杆菌微生物菌剂(有效活菌数≥5.0亿个/g)30 kg/hm2、有机肥2 250 kg/hm2。
生长期观察：施用复合微生物功能菌肥的处理出苗整齐健壮，长势较好；对照处理生长正常。
产量比较：施复合微生物功能菌肥的大白菜产量97 680 kg/hm2，比对照处理(91 920 kg/hm2)增产5 760 kg/hm2，增产率达到6.27%。
2.2.5
在沙白瓜上的应用效果
2017年在河北省乐亭县新寨镇后兰坨村进行了暖棚沙白瓜施用复合微生物功能菌肥的试验，在面积、水源、土质、管理技术和栽瓜时间一致，仅施肥不同的情况下，每棚施用复合微生物功能菌肥300 kg，对照每棚施用抗重茬微生物菌剂2 kg、有机肥300 kg、水溶菌肥5 kg，2个处理在投入上基本相当。
试验结果表明：对照处理的瓜秧长势参差不齐，连续2次提苗，不但增大了投入，而且延误了农时，使反季节栽培的沙白瓜失去了反季节优势，产品晚上市15~20 d；施用复合微生物功能菌肥的处理比对照处理多收入超过3 000元/棚，经济效益比对照处理增加了80%以上。
众多试验结果表明，复合微生物功能菌肥在粮食作物上的施用量在1 500~2 250 kg/hm2，棉花等经济作物的施用量在2 250~3 000 kg/hm2，瓜菜等经济作物的施用量在2 250~4 500 kg/hm2，果树等经济林木的施用量在7 500~9 000 kg/hm2，均有明显的增产效果。
3
结语
通过试验研究与生产应用证明，研发的复合微生物功能菌肥具有以下作用效果及特点。
(1) 改善作物根际微生态环境
通过微生物生命活动中的合成或分解作用，能改善由于长期施用化学肥料带来的土壤板结、理化性状差的状况，使作物根际土壤保墒、保肥，通透性良好，作物根系发达，耐旱能力增强[5]。同时，由于在作物根际形成有益优势菌落群体，能拮抗相对弱势的致病菌种群，消灭或削弱病原菌，从而减轻或避免作物发病。
(2) 在提高作物品质上优势明显
该产品具有平衡营养供给关系的作用，不仅可以改善农产品的外观品质、提高耐贮运性能，而且可以提高农产品口感、增加干物质的积累。
(3) 改善土壤的质量
通过产品中特定微生物种群的固氮、解磷、解钾等功能和微生物对作物根系的促生作用，不仅可以增进作物对养分的吸收，而且微生物种群的生命活动可以形成大量的腐殖质，改善土壤理化性状，避免化肥在土壤中的大量固定和流失，从而提高肥效。此外，由于微生物的分解、合成(如固氮等)作用[6]，可以提高原生土壤对根际的供肥量，减少化肥用量，从而实现增效节能。
(4) 生产成本低
与化学肥料相比，复合微生物功能菌肥生产时耗能少、生产成本低，并且由于微生物肥料的使用可提高化肥利用率30%~50%，从而降低了农业生产成本。
(5) 改善环境
复合微生物功能菌肥的主要原料为畜禽粪便等农业废弃物，通过微生物发酵制成微生物有机肥料，实现废物利用。同时，通过微生物肥料的分解、合成作用，减少空气中硫化氢、二氧化氮气体等有毒物质含量，实现养殖场的除臭处理，降解或转化土壤中重金属离子、硝酸盐等其他有害物质。
综上所述，利用微生物技术生产高效优质的功能性微生物肥料是发展生态农业、有机农业的需要，符合农业可持续发展战略的要求。
沪公网安备 31010702007066号