Evaluation of Uncertainty in Determination of Gibberellic Acid in Fertilizer by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Method
Abstract：
The content of gibberellic acid in fertilizers is determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry method, an uncertainty evaluation model is established, and the sources of uncertainty in the measurement process are analyzed and evaluated. By comparing the size of each component, it is concluded that the sources of uncertainty affecting the measurement result are mainly the fitting of the standard curve and the repeated measurement of the sample. The final calculated gibberellic acid synthesis standard uncertainty is 26.3 μg/kg, the extended uncertainty is 52.6 μg/kg, the measurement results can be expressed as [(432±52.6) μg/kg, k=2].
植物生长调节剂是由人工合成的化学物质或从生物中提取的天然植物激素，具有调节植物生长和发育的功能[1]。目前，世界上公认的植物生长调节剂有五大类，即生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯和脱落酸类[2]。其中，赤霉酸是一种广谱性植物生长调节剂，具有促进植物细胞分裂和种子发育、诱导花芽生长、提高瓜果植物的坐果率或促进无核果实的形成、叶菜类植物的营养生长等作用，也具有水果保鲜剂的作用。由于植物生长调节剂在较低的浓度下即可对植物的生长发育表现出良好的调节作用，因此，在农业生产中合理使用植物生长调节剂具有很好的效果[3]。到目前为止，我国批准登记的植物生长调节剂品种有38种共587个产品[4]。随着我国农业生产技术的快速发展，运用植物生长调节剂调控植物的生长和产量，已逐渐成为农业生产中必不可少的技术手段[5]。
肥料是农业生产中极为重要的生产资料，是保障国家粮食安全的重要物质基础，其质量直接影响农业生产及粮食安全。植物生长调节剂作为一种常用的农药产品，目前在全世界农业生产中得到了广泛应用，但不允许在肥料中随意添加。然而在高额利润的诱惑下，个别肥料生产商违规添加促进作物生长的调节剂，以增强肥料的肥效。近年来，一些不法肥料生产者及经营者，为了追求立竿见影的“肥效”，在肥料中违禁添加植物生长调节剂，对农产品的质量安全造成威胁。农产品中残留的植物生长调节剂通过食物链进入人体后，会对人体造成一定程度的伤害，轻则引起腹泻等疾病，重则导致人体免疫功能下降、骨骼疏松，甚至出现致畸、致癌、致基因突变等严重后果[3]。目前，肥料中隐性添加的赤霉酸既无限量指标要求，又缺乏规范统一的检测方法标准，严重影响政府监管工作的有效开展。随着肥料的广泛应用，政府监管部门要做好产品质量监管以及质量安全风险监测工作，国内急需建立肥料中赤霉酸的检测标准和方法，以规范行业行为，促进肥料产业健康发展。因此，建立肥料中赤霉酸含量的检测方法意义重大。
目前，肥料中赤霉酸的常用检测方法有高效液相色谱法[6]、高效液相色谱-质谱联用法(以下简称液质联用法)[1]等，但无论采用何种方法检测，测定结果都有一定的不确定度[7]。不确定度评定是检测结果的重要部分，反映了检测结果的可靠性以及检测过程中各项不确定度来源对测定结果的影响程度。为了表征检测工作和结果的准确性，实验室通常采用不确定度来对检测结果进行说明[8-9]。
由于液质联用法具有灵敏度高、定性定量准确等特点，同时目前针对肥料中赤霉酸含量检测的不确定度评定研究较少，在参考《测量不确定度评定与表示指南》[10]中的理论依据和建立不确定度数学模型的步骤以及其他相关文献资料[11]的基础上，采用液质联用法对肥料中的赤霉酸含量进行测定，对实验室采用的检验方法、所使用的仪器设备、标准物质及其溶液、标准曲线、样品处理过程等影响试验结果的因素进行不确定度评定[12-13], 以期找到影响测定结果可靠性的主要因素，从而对试验过程进行有效监控，保证最终数据的准确性和可靠性。
1
材料与方法
1.1
材料与试剂
赤霉酸标准品，质量分数98.0%，德国Dr. Ehrensforfer公司；甲醇，色谱纯，德国Merk公司；甲酸，分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司；超纯水，采用Mili-Pore超纯水系统制备；肥料样品，市售，水溶性肥料；初始流动相，甲酸-甲醇溶液(准确移取1.0 mL甲酸，用甲醇稀释至1 L)和甲酸溶液(准确移取1.0 mL甲酸，用水稀释至1 L)按体积比1 :9混合均匀，现配现用。
1.2
仪器与设备
4500QTRAP三重四级杆质谱联用仪, 美国AB公司；Agillent 1290高效液相色谱仪, 美国Agillent公司；Mili-Pore超纯水系统, 密理博公司；AL204-1C电子天平, 瑞士梅特勒-托利多公司；1 000 μL移液器和10 mL移液器，艾本德中国有限公司；漩涡混合器，上海安谱实验科技股份有限公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器公司；高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.3
试验方法
1.3.1
标准储备溶液和使用溶液的配制
准确称取赤霉酸标准品0.1 g(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到的赤霉酸标准储备溶液质量浓度为1 mg/mL。
用移液器吸取100 μL赤霉酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到的赤霉酸标准溶液质量浓度为1 μg/mL。
用移液器准确移取0、100、200、500、1 000和2 000 μL赤霉酸标准溶液分别置于10 mL容量瓶中，用初始流动相定容，得到质量浓度分别为0、10、20、50、100和200 μg/L的赤霉酸标准工作溶液。
1.3.2
样品前处理
称取1~2 g(精确至0.1 mg)样品于50 mL离心管中，加入20 mL流动相，用旋涡混合器均质1 min后于室温下超声30 min，然后置于转速为8 000 r/min的离心机内离心5 min，转移全部上层清液至25 mL容量瓶并用初始流动相定容，摇匀后取适量样品溶液经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，待测。
1.3.3
分析条件
试验选用InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱(3.0 mm×50.0 mm，2.7-Micron)；流动相A为甲酸-甲醇溶液，流动相B为甲酸溶液；进样量为5 μL。
质谱采用电喷雾电离源(ESI), 多反应监测(MRM)模式，定量离子为345.1/143.1，定性离子为345.1/239.2，离子化电压为-4 500 Ⅴ，离子源温度为500 ℃，去簇电压为-50 Ⅴ，碰撞电压为-20 Ⅴ。流动相梯度洗脱程序如表 1所示。
表 1
|
时间/ min |
流速/ (mL·min-1) |
流动相A:流动相B (体积比) |
|
0.00 |
0.4 |
40:60 |
|
1.00 |
0.4 |
40:60 |
|
1.50 |
0.4 |
60:40 |
|
3.00 |
0.4 |
90:10 |
|
4.50 |
0.4 |
40:60 |
|
5.00 |
0.4 |
40:60 |
1.3.4
数学模型的建立
试样中赤霉酸的含量按式(1)计算：
式中：W——试样中赤霉酸的含量，mg/kg；
C——试样溶液中赤霉酸的实测质量浓度，mg/L；
V——样品定容体积，mL；
f——样品溶液的稀释因子；
m——样品称样量，g。
根据检测过程及数学模型，可判断影响测定结果不确定度的来源有样品重复测定、标准曲线拟合、样品及标准物质称量、标准物质配制、样品定容以及标准物质纯度等，如图 1所示。
图 1
2
结果与分析
2.1
标准溶液及配制产生的相对不确定度urel(C)
2.1.1
标准储备溶液引入的相对不确定度urel(储)
根据赤霉酸标准物质证书，其质量分数＞98.0%，分散区间半宽为(100.0%~98.0%)/2=1.0%，即赤霉酸标准物质纯度为98.0%±1.0%。按照矩形分布，由赤霉酸标准物质引入的标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ，相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
AL204-1C电子天平的最大允许差为0.1 mg，取均匀分布，则标准品称量的标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ；标准品称样量为108.0 mg，则标准品称量相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
100 mL容量瓶(V1)A级单标线容量允许差是±0.1 mL，根据矩形分布计算，其标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。实验室温度为(20±5) ℃，由温度波动引起的体积变化呈均匀分布，k= 3；甲醇的体积膨胀系数为1.19×10-3 ℃-1，100 mL容量瓶因温度波动引起的体积标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。合成100 mL容量瓶定容体积引入的相对不确定度：
则标准储备溶液引入的相对不确定度：
2.1.2
标准溶液配制过程产生的不确定度
2.1.2.1
容量瓶引入的相对不确定度urel(V容)
标准溶液配制时采用初始流动相定容，可将初始流动相近似认为是质量分数10%的甲醇-水溶液。水的体积膨胀系数是2.10×10-4 ℃-1，在(20±5) ℃时由温度波动引起的体积相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
根据国家计量检定规程《常用玻璃量器》(JJG 196—2006)[14]规定，20 ℃时，100 mL A级容量瓶示值允许差为±0.100 mL，10 mL A级容量瓶示值允许差为±0.025 mL，两者的体积相对不确定度分别为： $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ， $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
则100 mL容量瓶和10 mL容量瓶体积的合成相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.1.2.2
移液器引入的相对不确定度urel(V器)
根据国家计量检定规程《移液器》(JJG 646—2006)[15]规定，1 000 μL移液器在100、200、500和1 000 μL检定点的容量允许误差分别为±2.0%、±1.0%、±1.0%和±1.0%，10 mL移液器在2 000 μL检定点的容量允许误差为±1.0%。按矩形分布， $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ，不同规格移液器移取不同移液点体积所引入的标准不确定度为：
式中：ti——容量允许误差；
V器——移液器规格，μL。
各可调移液器的容量允许误差及标准不确定度计算结果如表 2所示。
表 2
|
标准溶液质量浓度/ (μg·L-1) |
移液器规格/μL |
容量允许误差/% |
移液器引入的相对不确定度 |
|
10 |
1 000 |
±2.0 |
0.001 15 |
|
20 |
1 000 |
±1.0 |
0.000 58 |
|
50 |
1 000 |
±1.0 |
0.000 58 |
|
100 |
1 000 |
±1.0 |
0.000 58 |
|
200 |
10 000 |
±1.0 |
0.000 06 |
由移液器引入的合成相对不确定度urel(V器)= (0.001 152+0.000 582+0.000 582+0.000 582 +0.000 062)0.5=0.001 53。
2.1.3
标准溶液及配制产生的相对不确定度urel(C)
根据上述研究，赤霉酸标准溶液配制过程中产生的相对不确定度包括赤霉酸标准储备溶液配制过程引入的相对不确定度、所使用的容量瓶及移液器引入的相对不确定度，上述标准溶液配制产生的相对不确定度:
2.2
样品测定产生的相对不确定度urel(S)
2.2.1
样品称量产生的相对不确定度urel(m样)
使用AL204-1C电子天平称取1.500 0 g肥料样品，最大允许差0.1 mg，取均匀分布，则样品称量标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ，样品称量相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.2.2
样品前处理产生的相对不确定度urel(S前)
样品前处理过程包括离心、涡旋、超声、定容、摇匀、过滤等步骤，其中离心、涡旋、超声、摇匀、过滤等步骤产生的不确定度可通过测量重复性引入的不确定度分量表示，因此，此处样品前处理产生的不确定度主要由定容引入。样品前处理采用25 mL容量瓶定容，20 ℃时25 mL A级容量瓶示值允许误差为±0.040 mL，结合2.1.2.1，样品前处理产生的体积相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.2.3
样品重复性测定引入的相对不确定度urel(S重)
根据液质联用的分析条件，对肥料样品进行了10次测定，测定结果如表 3所示。
表 3
|
峰面积 |
赤霉酸质量浓度c/ (μg·L-1) |
|
67 800 |
24.8 |
|
68 900 |
25.2 |
|
68 900 |
25.2 |
|
70 200 |
25.7 |
|
71 400 |
26.1 |
|
71 400 |
26.1 |
|
68 700 |
25.1 |
|
73 900 |
27.1 |
|
73 100 |
26.8 |
|
73 100 |
26.8 |
根据表 3测定结果， $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ，样品测量结果的标准差(测定10次，p=10)为：
因此，样品重复性测定的标准不确定度uS重= S(c)=0.817 μg/L，样品重复性测定的相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.2.4
样品测定产生的相对不确定度urel(S)
根据上述研究，样品中赤霉酸测定产生的不确定度包括样品称量产生的不确定度、样品前处理产生的不确定度以及样品重复性测定引入的不确定度，上述样品测定产生的相对不确定度:
2.3
线性拟合过程引入的测量相对不确定度urel(c线)
配制的质量浓度依次为0、10、20、50、100和200 μg/L的标准工作溶液按照液质联用的分析条件分别进样3次，测量结果(表 4)通过最小二乘法拟合得到的标准曲线方程为y=2 537.9x+1 051.3，R2=0.999 9， $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
表 4
|
质量浓度xi/ (μg·L-1) |
y1 |
y2 |
y3 |
$ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ |
yfi |
|
10 |
21 200 |
23 200 |
25 000 |
23 133.3 |
25 818.5 |
|
20 |
52 300 |
54 800 |
56 900 |
54 666.7 |
52 730.5 |
|
50 |
131 200 |
130 900 |
133 000 |
131 700.0 |
133 466.5 |
|
100 |
271 400 |
272 500 |
273 000 |
272 300.0 |
268 026.5 |
|
200 |
535 400 |
532 800 |
538 000 |
535 400.0 |
537 146.5 |
根据表 4数据，可计算得出峰面积测量的标准偏差为：
式中：yi——由仪器检测各点的相应峰面积；
yfi——由标准曲线方程计算得到的峰面积；
n——配制5个标准工作溶液，每个浓度点测定3次，共计15次，即n=15。
当对样品进行测量时，被测量的样品浓度是由峰面积通过最小二乘法拟合的线性方程得到，因此由标准曲线拟合引入的测量结果的标准不确定度为：
式中：b——拟合直线的斜率；
p——试样平行测定次数，p=10；
$ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ——标准工作溶液质量浓度平均值，μg/L；
$ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ ——本试验样品测得值的平均值，μg/L；
xi——标准工作溶液的质量浓度，μg/L。
由线性拟合过程引入的测量相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.4
液质联用仪校准引起的相对不确定度urel(Q)
根据液质联用仪的仪器校准证书, u=2%，取均匀分布， $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ , 则相对不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.5
相对不确定度urel(X)的合成
液质联用法测定肥料样品中赤霉酸含量的相对不确定度主要包括标准溶液及配制产生的相对不确定度urel(C)、样品测定产生的相对不确定度urel(S)、线性拟合过程引入的测量相对不确定度urel(c线)和液质联用仪校准引起的相对不确定度urel(Q), 将上述各分量合成相对不确定度urel(X)为：
样品中赤霉酸含量为432 μg/kg，合成标准不确定度 $ W = \frac{{C \times V \times f}}{m} $ 。
2.6
扩展不确定度及测定结果报告
95%置信概率下取包含因子k=2，将合成相对不确定度乘以包含因子计算得到的肥料样品中赤霉酸含量测定结果的扩展不确定度uX=urel(X)× k=26.3×2=52.6(μg/kg)，故液质联用法测定肥料中赤霉酸含量的结果报告表示为(432±52.6) μg/kg。
3
结果与讨论
通过建立液质联用法测定肥料中赤霉酸含量的不确定度评价模型，从而保证肥料中赤霉酸含量测定结果的有效性和合理性，为液质联用法测定肥料中赤霉酸含量的质量控制提供了有效、可靠的测量体系。
结果表明，肥料中赤霉酸的含量为(432±52.6) μg/kg，k=2。从各相对不确定度分量的贡献率分析(表 5)可知，试验过程中，测量不确定度主要来源于两个方面，即样品浓度测定中标准曲线的拟合引入的相对不确定度和样品重复测定引入的相对不确定度，而标准物质纯度、标准物质和样品的称量、样品前处理的相对不确定度影响不大。因此，在测定过程中，检测人员应掌握实验操作技能，增加标准曲线的浓度水平数以减少由拟合曲线带来的影响，并增加平行测量次数以减少测试重复性对结果的影响；同时，加强设备的日常维护和管理，尽可能保证试验结果的稳定性和准确性。
表 5
|
不确定度分量 |
数值 |
贡献率/% |
|
标准储备溶液引入的相对不确定度urel(储) |
0.006 86 |
6.63 |
|
标准溶液配制过程中使用容量瓶产生的相对不确定度urel(V容) |
0.001 05 |
1.02 |
|
标准溶液配制过程中使用移液器产生的相对不确定度urel(V器) |
0.001 53 |
1.48 |
|
样品称量产生的相对不确定度urel(m样) |
0.000 04 |
0.04 |
|
样品前处理产生的相对不确定度urel(S前) |
0.000 65 |
0.63 |
|
样品重复性测定引入的相对不确定度urel(S重) |
0.031 54 |
30.50 |
|
线性拟合过程引入的测量相对不确定度urel(c线) |
0.050 18 |
48.53 |
|
液质联用仪校准引起的相对不确定度urel(Q) |
0.011 55 |
11.17 |
|
合成相对不确定度urel(X) |
0.060 81 |
100.00 |
沪公网安备 31010702007066号