高效液相色谱法测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量

Determination of Indole-3-Acetic Acid and Indole Butyric Acid in Fertilizers by High Performance Liquid Chromatography

张娟 Juan ZHANG , 朱海荣 Hairong ZHU , 董茜 Qian DONG , 刘爽 Shuang LIU , 邹惠玲 Huiling ZOU , 张开亮 Kailiang ZHANG , 苏本玉 Benyu SU

1 山东省产品质量检验研究院山东济南 250100 Shandong Institute for Product Quality Inspection, Jinan, Shandong 250100, China 2 上海化工研究院有限公司上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd., Shanghai 200062, China

摘要：

建立了液相色谱法同时测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的分析方法。样品经甲醇涡旋振荡、超声提取后，以ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)为分离柱，用甲醇和2.0%(体积分数)的乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在检测波长280 nm处进行测定。试验结果表明：吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的质量浓度均在1.0~100.0 mg/L范围内与其对应的峰面积呈线性关系，检出限为5 mg/kg，定量限为10 mg/kg。样品的加标回收率为91.46%~104.5%，相对标准偏差为2.0%~4.7%。该方法测定结果准确、灵敏度高，可满足肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的测定。

关键词：

高效液相色谱法; 吲哚-3-乙酸; 吲哚丁酸; 植物生长调节剂; 肥料;

Abstract：

An analytical method for simultaneous determination of indole-3-acetic acid and indole butyric acid in fertilizers by liquid chromatography has been established. the ZORBAX SB-C₁₈ column (250 mm×4.6 mm, 5.0 μm) is used as the separation column, and methanol and 2.0% (volume fraction) acetic acid solution are used as mobile phases for gradient elution, after methanol vortex oscillation and ultrasonic extraction, the sample is measured at the detection wavelength of 280 nm. The results show that the mass concentrations of indole-3-acetic acid and indole butyric acid are linearly related to their corresponding peak areas within the range of 1.0~100.0 mg/L. The detection limit is 5 mg/kg and the quantification limit is 10 mg/kg; the sample recovery rate is 91.46%~104.5%, and the relative standard deviation is 2.0%~4.7%. The method has accurate results and high sensitivity, which can meet the requirements for determination of indole-3-acetic acid and indole butyric acid in fertilizers.

Keyword：

high performance liquid chromatography; indole-3-acetic acid; indole butyric acid; plant growth regulator; fertilizer;

吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸是常用的植物生长调节剂类农药，同时也是植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物。吲哚-3-乙酸对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用。吲哚丁酸是植物主根生长促进剂，常用于木本和草本植物的浸根移栽、硬枝扦插，能加速根的生长^[1]，提高植物生根的百分率，也可用于植物种子的浸种和拌种，可提高发芽率和成活率。我国相关法规规定，含有农药成分的肥料产品必须以农药产品的登记方式进行登记，但由于农药产品登记周期长、费用高，一些不法厂商为了谋取不正当利益，在肥料中违禁添加吲哚-3-乙酸或吲哚丁酸，以突显所谓“肥效”。此种做法对农产品质量安全、生态环境以及人体健康造成潜在威胁。因此，建立准确度高、稳定性好的测定肥料产品中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量的方法非常必要。

目前测定植物生长调节剂的方法主要有生物鉴定法、免疫检测法、光谱法^[2-4]、色谱法[包括气相色谱法^[5]、液相色谱法^[6]、液相色谱-质谱联用技术(简称液质联用法)^[7]等]，其中测定吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的主要方法为液相色谱法^[8-9]和液质联用法^[10-14]等。与液质联用法相比，液相色谱法相对经济、快捷，本文建立了同时测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的高效液相色谱法，可为肥料产品质量安全提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器和自动进样器，色谱工作站，美国Agilent公司；Sigma 3-18K型高速冷冻离心机，德国Sigma公司；电子天平，瑞士Sartorius公司；SIR型漩涡混合器，德国IKA公司。

标准品：吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸，质量分数均为98.0%，美国Stanford Chemicals公司。

混合标准溶液：准确称取0.01 g(精确至0.000 1 g)的吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，配制成吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸质量浓度均为1 000 mg/L的标准溶液，现用现配。

甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；乙酸为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水为一级水。

1.2 仪器条件

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)或分离性能相当的色谱柱；检测器：二极管阵列(PDA)检测器；检测波长：280 nm；流动相：甲醇溶液(A)和体积分数为2.0%的乙酸水溶液(B)，高效液相色谱梯度洗脱程序见表 1；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：10.0 μL。

表 1

梯度洗脱程序

时间/min	流动相A(体积分数)/%	流动相B(体积分数)/%
0	40	60
15.0	40	60
15.1	55	45
30.0	55	45
30.1	40	60
33.0	40	60

1.3 试验方法

称取1.0 g肥料样品(精确至0.000 1 g)，置于50 mL比色管中，加入20 mL甲醇，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，在高速离心机中以6 000 r/min的转速离心10 min，全部上清液转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.4 标准曲线

分别移取一系列吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准溶液(1 000 mg/L)于7个容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L的混合标准工作溶液。按照质量浓度由低到高的顺序测定，以吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的质量浓度在1.0~100.0 mg/L范围内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程分别为y= 17.461 82x-8.312 23和y=14.619 64x-5.572 51，相关系数分别为0.999 7和0.999 8。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

2.1.1 检测器

PDA检测器灵敏度高、检出限低，对流速和温度波动不敏感，在波长190~490 nm内进行检测可获得相应的色谱图。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸在200~400 nm范围内皆有一定的紫外吸收，因此试验选用PDA检测器。

2.1.2 检测波长

对50 mg/L混合标准工作溶液从190~490 nm进行全波段扫描，经PDA检测器扫描显示，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸在波长210~290 nm内有一定的吸收，但低波长下杂质峰的干扰较大；在280 nm处，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸杂质干扰较小，且皆具有较强的吸收峰。因此，试验选择吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的检测波长为280 nm。

2.2 流动相

试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(体积分数，下同)的甲酸水溶液以及甲醇-2.0%的乙酸水溶液等4种体系作为流动相。结果显示：在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%的甲酸水溶液等3种体系作为流动相得到的谱图中，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的吸收峰有严重的拖尾现象；而在甲醇-2.0%的乙酸水溶液体系中的洗脱效果最好，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的分离度良好且峰形尖锐，满足试验要求。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准溶液的典型色谱图见图 1。

图 1

吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准溶液的典型色谱图

2.3 前处理方法

振荡、涡旋和超声是目前液固提取、液液提取较常用的手段，不同肥料样品对提取液的亲和性不同。为了提高样品中吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的提取效果，试验在加入提取剂后，分别考察了振荡、涡旋、超声、振荡后超声及涡旋后超声等5种提取方式，结果见表 2。

表 2

不同提取方式对提取效果的影响

样号	提取方式	回收率/%
样号	提取方式	吲哚-3-乙酸	吲哚丁酸
11	振荡1 min	45.12	41.29
	涡旋1 min	52.65	49.28
	超声30 min	75.14	72.34
	振荡1 min后，超声30 min	85.68	84.31
	涡旋1 min后，超声30 min	95.15	96.62
12	振荡1 min	40.37	39.25
	涡旋1 min	43.68	45.38
	超声30 min	79.16	75.21
	振荡1 min后，超声30 min	86.39	83.74
	涡旋1 min后，超声30 min	98.34	99.25

由表 2可知：振荡、涡旋、超声等3种方式难以达到良好的提取效果；试验采用漩涡混合器均质1 min，再超声30 min使样品充分浸润分散，测试样品的回收率为95.15%~99.25%，提取效果良好。

3 方法的验证

3.1 方法的灵敏度

基于实际空白样品中添加吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸混合标准溶液分析结果，按信噪比为3对应的质量分数计算方法的检出限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的检出限为5 mg/kg；按信噪比为10对应的质量分数计算方法的定量限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的定量限为10 mg/kg。

3.2 方法的精密度

对空白加标样品进行精密度试验，样品加标后试样溶液的质量浓度分别为20.00、50.00 mg/L，平行测定6次，计算精密度，结果见表 3。试验结果表明，测定结果的相对标准偏差(RSD)小于5%，说明本方法具有良好的重复性和再现性，可满足检测要求。

表 3

加标回收和精密度试验结果(n=6)

化合物	加标量/(mg·L^-1)	回收量/(mg·L^-1)	RSD/%
吲哚-3-乙酸	20.00	20.45，21.52，20.65，19.14，19.96，20.43	3.9
吲哚-3-乙酸	50.00	50.68，50.32，51.22，48.26，49.65，50.26	2.0
吲哚丁酸	20.00	19.59，19.62，21.44，20.96，20.54，21.99	4.7
吲哚丁酸	50.00	50.46，51.63，51.88，48.26，49.25，48.26	3.2

3.3 回收试验

选取6个实际肥料样品，每个样品平行测定2次，取测定结果的平均值作为本底值。在样品中加入20.00 mg/L混合标准溶液，试验结果扣除本底值，剔除离群值后，分别计算测定结果的平均值和加标回收率，结果见表 4。

表 4

实际样品的加标回收试验结果

样号	回收率/%
样号	吲哚-3-乙酸	吲哚丁酸
1	92.58	91.46
2	94.15	96.44
3	93.45	94.98
4	94.85	93.74
5	102.6	103.1
6	104.5	103.2

由表 4可知，肥料样品中吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的加标回收率为91.46%~104.5%，表明方法的准确度较高。

4 结语

本文建立的高效液相色谱法适用于同时测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的含量，线性范围为1.0~100.0 mg/L，测定范围宽，基质干扰小，色谱分离效果好，检出限为5 mg/kg，具有良好的精密度，回收率高，定量准确。

ckwx 参考文献

刘昊, 宋晓波, 周乃富, 等.吲哚丁酸对核桃嫩枝扦插生根及内源激素变化的影响[J].浙江农林大学学报, 2017, 34(6): 1038-1043.

HAN X Q, FAN J L, LU H Z, et al. Synthesis, resolution and biological evaluation of cyclopropyl analogs of abscisic acid[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2015, 23(18): 6210-6217.

张良, 王泉振, 王宁, 等.直接竞争酶联免疫吸附-高效液相色谱法测定烯效唑[J].分析化学, 2012, 40(11): 1730-1734.

米娟, 周敏, 丁兰, 等.固相萃取-化学发光法测定植物中的吲哚乙酸[J].分析试验室, 2011, 30(8): 44-47.

BHATTACHERJEE A K, SINGH V K. Paclobutrazol estimation by gas chromatography-A new method for its residue analysis in soil[J]. Indian Journal of Plant Physiology, 2002, 7(1): 282-284.

HU J Y, DENG Z B, QIN D M. Determination of diacylhydrazines-type insect growth regulator js-118 residues in cabbage and soil by high performance liquid chromatography with dad detection[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2009, 83(6): 803.

曹慧, 陈小珍, 王瑾, 等.超高效液相色谱-串联质谱技术同时分析食品中多种植物激素残留[J].农药, 2012, 51(10): 738-741.

TRENHOLM R A, VANDERFORD B J, DREWES J E, et al. Determination of household chemicals using gas chromatography and liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1190(1-2): 253-262.

王佳祥, 王珊珊, 赵平.高效液相色谱法同时测定蔬菜及水果中的吲哚丁酸和萘乙酸[J].化学工程师, 2013, 27(5): 23-25.

刘志航, 李平亮, 周斐, 等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测植物叶片中吲哚-3-乙酸及其3种氧化产物[J].分析测试学报, 2017, 36(6): 732-737.

叶佳明, 王京, 钟世欢, 等.高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中6种植物生长调节剂的残留[J].农产品加工, 2018(2): 39-42.

李华, 郭启高, 梁国鲁, 等.利用高效液相色谱法同时测定枇杷果实中10种植物激素[J].西南大学学报(自然科学版), 2018, 40(3): 18-25.

CAO S R, ZHOU X, XI C X, et al. Cleaning up vegetable samples using a modified ″ quechers″ procedure for the determination of 17 plant growth regulator residues by ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry[J]. Food Analytical Methods, 2016, 9: 2097-2104.

LIU S J, WU Y N, FANG C G, et al. Simultaneous determination of 19 plant growth regulator residues in plant-originated foods by quechers and stable isotope dilution-ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Analytical Sciences, 2017, 33(9): 1047-1052.