海带发酵降解的复合菌种筛选及海藻寡糖产物的检测

Screening of Composite Strains for Fermentation Degradation of Kelp and Detection of Algae-Oligosaccharides in Product

陈营 Ying CHEN , 孙业梅 Yemei SUN , 杨丹丹 Dandan YANG , 郭琳 Lin GUO

烟台大学生命科学学院山东烟台 264005 College of Life Sciences, Yantai University, Yantai, Shandong 264005, China

摘要：

从实验室保存的海带降解菌群中分离出3种不同菌落形态的菌株(Lj1、Lj2和Lj3)，经交叉划线法和滤纸片法对分离得到的菌株进行相互作用分析，结果发现Lj1与Lj2之间存在相互促进作用；应用分离得到的菌株混合发酵海带，在235 nm波长处测定产物中海藻寡糖的含量，结果表明以Lj1与Lj2组合为最高，稀释50倍后的吸光度为0.784。经细菌16S rDNA测序鉴定，Lj1和Lj2分别为印度斯塔普氏菌和陶氏假单胞菌。采用Lj1与Lj2复合菌种发酵海带，3~4 d可使培养基中质量分数30%的湿海带的分解率达90%以上，产物中的海藻寡糖推测为单一组分的三糖。

关键词：

海带; 发酵降解; 海藻寡糖; 复合菌种; 海洋细菌;

Abstract：

Three strains with different colony morphologies (Lj1, Lj2 and Lj3) are isolated from the kelp-degrading flora preserved in the laboratory. The interaction analysis of the isolated strains by the cross-streak method and the filter paper method shows that there is a mutual promotion effect between Lj1 and Lj2; the separated strains are used for mixed fermentation of kelp, and the content of algae-oligosaccharides in the product is measured at a wavelength of 235 nm. The results show that the combination of Lj1 and Lj2 is the highest, and the absorbance after dilution 50 times is 0.784. After bacterial 16S rDNA sequencing, Lj1 and Lj2 are identified as Stappia indica and Pseudomonas taeanensis respectively. Using Lj1 and Lj2 composite strains to ferment kelp, the decomposition rate of wet kelp with a mass fraction of 30% in the culture medium can reach more than 90% in 3 to 4 days, and the algae-oligosaccharides in the product are presumed to be trisaccharide of a single component.

Keyword：

kelp; fermentation degradation; algae-oligosaccharides; composite strains; marine bacteria;

海带(Laminaria japonica)又名昆布，是生长于海洋中的大型褐藻，归属于光能自养型微生物^[1]，是我国历史最悠久的食用及药用藻类之一。我国的褐藻资源丰富，海带在我国北部及东南沿海地区均有大量养殖，是养殖规模最大的重要经济藻类，具有独特的工业和食用价值。海带常年生长在低温的环境中，生长速度快、适应能力强，藻体中含有大量陆生生物不具有的营养物质和生物活性成分^[2]，作为植物生物刺激素在农业中有着广阔的开发和应用前景^[3]。

以海带为主要原料制备海藻肥料，通常采用化学、物理和生物的方法提取海带的有效成分，其中的标志性物质是海藻酸。海藻酸是一种酸性大分子的多糖物质，占藻体干质量的22%~44%^[4]。当海藻酸以高聚合度的大分子状态存在时，黏度大、吸收利用差等特性限制了其应用的范围^[5]。同时，海藻酸构成了海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞壁的主要成分，也是藻体细胞间骨架的基质^[6]。经过提取处理后，海带藻体结构被破坏，释放出细胞内的全部营养物质。而海藻酸或其黏度降低，或变成小分子海藻寡糖，水溶性和吸收度增大，呈现更多的生物活性作用，如植物生长的刺激作用和植物抗病力的诱导效应^[2]。在海藻的各种提取方法中，生物法因其条件温和可控、特异性强、绿色无污染，日益受到人们的重视。因此，筛选海带降解菌或降解酶，最大程度地保证海藻有效成分的完整性，对海藻提取物的应用是至关重要的^[3]。目前，大部分的海带降解菌或降解酶都源于海洋细菌，如弧菌(Vibrio)^{[5, 7-9]}、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)^[10-11]、交替单胞菌(Alteromonas)^[12]、芽孢杆菌(Bacillus)^[13]、Shewanella^[14]、Tamlana^[15]。生物法的优势除了反应温和、无营养损失外，其产物也独具特殊性。海藻酸经过微生物酶的裂解后，其产物海藻寡糖的非还原端C4与C5间会产生一个双键，在波长235 nm处有最大吸收峰，通过比色法可以测定海藻寡糖的含量^[16]。由此制备的非饱和寡糖具有生物学活性，而由其他方法制备的饱和寡糖则不具有^[10]。

本文从实验室保存的海带降解菌群中分离纯化出相关的海带降解菌，通过分析菌种之间的相互作用，检测发酵产物中海藻寡糖的组成和含量，筛选并重新组成复合微生物菌种，用于海带发酵降解制备海藻寡糖的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

样品，购于烟台本地市场的干海带；菌种，本实验室保存于海带发酵液中的海带降解菌群；培养基，富集培养基等参考文献[17]。

1.2 试验设备

VD-850型桌上式洁净工作台，苏州净化设备有限公司；TG16-W型微量高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；LDZX-40BⅠ型立式全自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂；HZQ-F160型振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；UV-1900型紫外-可见分光光度计，翔艺仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 海带降解菌群的活化及分离纯化

取保存的海带发酵液，按5%(体积分数，下同)接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养至海带片90%以上分解。继续传代培养2次，直至海带分解效果稳定。取海带降解液进行适当稀释后，涂布牛肉膏蛋白胨平板。待平板上有菌落生长后，选取形态不同的菌落反复几次划线培养，纯化后的菌种留待备用。

1.3.2 微生物菌种之间的相互作用分析

(1) 交叉划线法^[18]。将纯化的菌种两两之间在牛肉膏蛋白胨平板表面交叉划线，培养后在两种菌交叉的地方观察细菌生长情况。交叉处细菌的生长如果优于单一划线处的细菌，说明两种菌之间有相互促进的作用；反之，说明细菌之间没有相互促进作用。

(2) 滤纸片法^[19]。先选择一种菌液涂布于平板表面，然后将灭菌的滤纸片浸入其他的菌悬液中，待滤纸片微干后贴于培养基表面，培养后观察滤纸片周围细菌的生长情况。若滤纸片周围的细菌生长得更好，说明两细菌之间有相互促进作用；反之，则无作用。

1.3.3 海带的混合发酵与海藻寡糖含量的测定

取纯化的菌种，以等比例混合接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养4 d。以各自单一菌种接种富集培养基和空白培养基作对照，每组均为两个平行。发酵结束后，取各自海带发酵液以4 000 r/min离心10 min，再取上清液稀释40~50倍，在波长235 nm下测定吸光度，即可比较各发酵液中海藻寡糖含量的差异，从而确定海带分解的效果。

1.3.4 海带发酵复合菌种的比例分析

从上述海带的混合发酵中，选取海带分解达到90%以上和海藻寡糖含量较高的组合，采用平板培养法对最终发酵液中的菌种计数，确定混合发酵的接种比例。

1.3.5 复合菌种发酵产物的薄层层析

薄层层析所用展开剂为正丁醇:乙酸乙酯:异丙醇:冰乙酸:水(2 : 6 : 6 : 4 : 1)。将点样的硅胶板放于盛有展开剂的层析缸中，在50 ℃下待样品扩散至距硅胶板顶端约1 cm处，取出在70 ℃烘烤30 min。烘干后，均匀喷体积分数为30%的硫酸溶液进行显色，并在110 ℃烘烤10 min后观察。以质量分数为1%的葡萄糖、蔗糖溶液作为对照。

1.3.6 混合发酵复合菌种的鉴定

试验采用煮沸法提取细菌基因组，并进行16S rDNA测序鉴定。PCR扩增引物为细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

2 结果与分析

2.1 海带降解菌的分离和纯化

对实验室保存的海带发酵液进行连续传代培养，在37 ℃、160 r/min条件下培养3~4 d，海带分解达到90%以上。这是一个海带降解菌群的富集培养液，经过近3年的保存，其混合菌群的种类逐渐变少，但降解海带的效果仍然很好。经平板涂布分离及划线纯化后，共获得3种不同菌落形态的菌株，分别命名为Lj1、Lj2和Lj3。

2.2 微生物菌种之间的相互作用

在交叉划线试验中，Lj1和Lj2交叉划线处的细菌生长优于单菌生长，两菌株之间可能存在相互促进作用；Lj2和Lj3交叉划线处的细菌生长较差，不如单菌生长，两菌株之间可能有抑制作用；Lj1和Lj3之间的关系不是很明显。

在交叉划线试验的基础上进行滤纸片法分析，先将Lj2涂布于平板上，再将浸有Lj1和Lj3的滤纸片贴在平板表面。结果表明：Lj2的代谢产物促进了Lj1的生长，进一步确定了两者之间的协同作用；Lj2和Lj3之间作用不明显或没有促进作用。

2.3 海带发酵复合菌种的筛选

经过检测混合发酵液中海藻寡糖的含量，以Lj1+Lj2组合的含量最高，稀释50倍后的平均吸光度为0.784，其次为Lj1+Lj3和Lj2+Lj3组合。3种菌株的组合和单一菌株发酵液中，海藻寡糖含量均较低，与空白对照相当，结果见图 1。

图 1

海带发酵液中海藻寡糖含量测定结果

结合海带的分解效果，也是Lj1+Lj2组合中的海带分解最好，在3~4 d可使质量分数30%的湿海带分解率达90%以上。因此，选用Lj1+Lj2组合作为海带发酵降解的复合菌种。

2.4 海带发酵的复合菌种鉴定、菌种比例及产物组成

利用Lj1+Lj2复合菌种发酵海带，起始接种时两者是等比例混合。由于两者之间的偏利共生关系，即Lj2促进Lj1生长的现象，经过3~4 d的混合培养，在发酵结束后经平板计数，最终Lj1和Lj2的活菌数比例变为3: 2。这个比例是两者在海带中的最佳比例，也应该是发酵起始接种的合适比例。

复合菌种分别经细菌16S rDNA测序鉴定，Lj1为印度斯塔普氏菌(Stappia indica)，Lj2为陶氏假单胞菌(Pseudomonas taeanensis)。斯塔普氏菌是一种不常见的细菌，而假单胞菌在自然界中广泛存在，对各种碳源物质的利用种类最多、能力最强。

通过薄层层析对海带发酵液中海藻寡糖种类进行分析时发现，海带发酵液的层析斑点完整、不拖尾，在蔗糖附近略靠下的位置。由此可以推测海带发酵液中的海藻寡糖大致为单一组分的三糖，见图 2。

图 2

海带发酵液的薄层层析分析

3 结语

海带的细胞壁组成十分复杂，含有海藻酸和其他的多糖成分，这些可以成为微生物生长繁殖的营养物质和能源^[20]。只有能利用这些物质的微生物才能将其降解成小分子，破坏细胞壁的保护结构，释放出细胞内的营养物质。因此，利用不同菌种的代谢酶系，可以更好地协同作用，更快、更有效地降解海带。从实验室保存的海带降解菌群中共获得3株细菌，通过分析两种不同方法的菌种之间的相互作用，得出Stappia indica和Pseudomonas taeanensis之间有协同促进作用；对不同菌种组合的海带发酵产物进行235 nm光吸收检测，也表明这两个菌种组合产生的海藻寡糖含量最高，分解海带的效果最好，而任一单菌种或其他组合效果都不好。所以，后续的研究选用Stappia indica和Pseudomonas taeanensis作为海带发酵降解的复合菌种。Sun等^[21]在海带的表面分离到一株细菌Bordetella sp. HZ20，这株菌没有分解海带的能力，但可能具有分解几丁质和聚羟基脂肪酸酯(PHA)酶系的能力，与其他菌共同参与碳、氮、磷、硫的代谢，这或许是该菌在海带表面生态系统中存在的意义。

试验分离的假单胞菌是自然界中利用碳源物质能力最强的细菌，如海带含有的各种多糖。在与斯塔普氏菌混合发酵海带的过程中，假单胞菌产生的代谢产物促进Stappia indica的生长，两者共同作用使海带降解。Stappia indica在这个过程中可能具有独特针对海带中某种成分的利用和分解能力，有待进一步验证。此复合菌种在4 d之内可使质量分数30%的湿海带几乎全分解，而且产物经薄层层析推测为单一的三糖。柏超^[15]从海带降解菌群中分离到两株高效降解菌株，其中假单胞菌具有淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和海藻酸裂解酶活性，Tamlana具有海藻酸裂解酶活性。利用这两株菌的重新组合，只需要5 d就可以把培养基中质量分数20%的海带块完全降解。姚艳艳等^[8]利用弧菌YY7菌株发酵液降解海带粉，酶解6 h的降解率可达65%以上。汤海青^[10]通过薄层层析推测由海藻酸裂解酶制备的产物为寡糖混合液，各寡糖的聚合度为2~9，其中以聚合度2~6的寡糖为主，酶解的终产物为二糖和三糖。可见，从不同环境分离的菌株，降解海带的能力不同。菌种的组合不同、反应条件不同，对海带的降解效率和产物组成是有差异的。为实现海带发酵降解的工业化生产，后续还将进行菌种的稳定性和发酵工艺优化的研究。同时，亟待建立检测海藻寡糖的方法并制定相应的标准。

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