超高效液相色谱法测定稳定性肥料中双氰胺含量的不确定度评定

Evaluation of Uncertainty in Determination of Dicyandiamide Content in Stabilized Fertilizer by Ultra-High Performance Liquid Chromatography

黄河清 Heqing HUANG , 高文君 Wenjun GAO , 牛彦超 Yanchao NIU

上海化工研究院有限公司/上海化工院检测有限公司上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd./Shanghai Institute of Chemical Industry Testing Co., Ltd., Shanghai 200062, China

摘要：

根据行业标准《肥料增效剂双氰胺含量的测定》(NY/T 2877—2015)，采用超高效液相色谱法测定稳定性肥料中双氰胺的含量，对测定过程中的不确定度来源进行了分析，主要为标准溶液配制、标准曲线拟合、样品制备、样品测量重复性等4个方面。按《测定不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)的规定进行不确定度计算，双氰胺含量的测量不确定度来源主要为标准溶液配制与标准曲线拟合。稳定性肥料中双氰胺的合成标准不确定度为0.002 4%，扩展不确定度为0.005%，测定结果为0.168%±0.005%(k=2)。

关键词：

双氰胺; 稳定性肥料; 超高效液相色谱法; 不确定度;

Abstract：

According to the industry standard "Fertilizer synergists—Determination of dicyandiamide content" (NY/T 2877—2015), the content of dicyandiamide in stabilized fertilizer is determined by ultra-high performance liquid chromatography, and the sources of uncertainty in the determination process are analyzed mainly in four aspects: standard solution preparation, standard curve fitting, sample preparation, and sample measurement repeatability. The uncertainty is calculated according to the "Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement" (JJF 1059.1—2012). The sources of uncertainty in the measurement of dicyandiamide content mainly come from standard solution preparation and standard curve fitting. The synthetic standard uncertainty of dicyandiamide in stabilized fertilizer is 0.002 4%, the expanded uncertainty is 0.005%, and the measurement result is 0.168%±0.005% (k=2).

Keyword：

dicyandiamide; stabilized fertilizer; ultra-high performance liquid chromatography; uncertainty;

氮肥施用入土后会在多种土壤微生物及其分泌的酶作用下，经历一系列生物化学反应，从而导致其形态发生改变。未被作物吸收利用的氮素，主要以硝态氮形态流失和反硝化作用脱氮损失^[1]。氮肥施用过程中，氮素以硝态氮形式大量流失，不但降低了氮肥的利用率，缩短了肥效期，而且也导致了环境污染等问题^[2]。

稳定性肥料是一类添加了脲酶抑制剂和/或硝化抑制剂等增效助剂的含氮肥料，可使肥效得到延长。其中，双氰胺(DCD)能够通过降低氨氧化微生物中氨单加氧酶(AMO)的活性来暂时抑制硝化作用^[3]，是一种常见的硝化抑制剂，适合与各种铵态氮肥或尿素配合施用。氮肥中双氰胺的添加量不但会影响其硝化抑制作用，还会因其过量存在对农作物的生长及土壤和环境造成持续负面影响，因此需要对肥料中双氰胺的含量进行检测与监控。

测量不确定度是表征合理赋予被测量的值的分散性，是与测量结果相关联的参数^[4]，只有包含测量不确定度说明的测量结果才是完整的^[5-6]。本文按照行业标准《肥料增效剂双氰胺含量的测定》(NY/T 2877—2015)^[7]，采用超高效液相色谱法(UPLC)对稳定性肥料中双氰胺的含量进行了测定，依据《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)^[4]对其测定结果的不确定度进行了评定，以期为实验室类似评定工作提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器及试剂

WATERS ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪－二极管阵列检测器，美国沃特世公司；AL204-1C型分析天平，METTLER TOLEDO；SHA-C型数显水浴恒温振荡器，上海易友仪器有限公司；20~200 μL、100~1 000 μL移液器，Eppendorf。

双氰胺标准物质，质量分数99.2%，CATO Research Chemicals Inc.；乙腈，色谱纯，CNW Technologies；超纯水。

双氰胺标准溶液：称取双氰胺标准物质1.000 8 g，用水定容至100 mL，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备溶液；分别移取标准储备溶液50、80、100、200、500 μL，用水定容至10 mL，配制成质量浓度分别为5.00、8.00、10.0、20.0、50.0 mg/L的双氰胺系列标准溶液。

1.2 试验条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱温：40 ℃；流动相：超纯水－乙腈(90+10)；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；提取波长：220 nm。

1.3 试验步骤

称取稳定性肥料样品约1 g于100 mL容量瓶中，加入约40 mL水，塞紧瓶塞，摇动容量瓶使样品分散，用频率为180 r/min的振荡器连续振荡30 min，取出，用水定容并摇匀，过0.22 μm水性滤膜针头滤器，进样测定。

按质量浓度从低到高依次进样测定。以双氰胺质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得到线性回归方程。

样品溶液及标准溶液均重复进样3次，超高效液相色谱法测定双氰胺含量流程见图 1。

图 1

超高效液相色谱法测定双氰胺含量流程

1.4 测定结果的数学模型

按式(1)计算双氰胺质量分数：

图 1

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

式中：w——试样中双氰胺质量分数，%；

ρ——由标准曲线计算得到的试样溶液中双氰胺的质量浓度，mg/L；

V——试样定容体积，mL；

m——试样称样量，g。

2 不确定度来源分析

根据测量步骤及上述数学模型可知，影响UPLC法测定稳定性肥料中双氰胺含量的不确定度的主要来源有测量重复性(A类不确定度)、标准溶液配制、最小二乘法拟合标准曲线、样品溶液制备(天平称量、定容体积和温度变化)等，各来源间关系见图 2。

图 2

双氰胺含量测定不确定度来源关系

3 结果与讨论

3.1 测定结果

对上述配制的5个双氰胺系列标准溶液分别测定3次，双氰胺质量浓度与对应的峰面积建立的线性回归方程为A=41 618.74ρ+11 655.24，相关系数r为0.999 9(见表 1)。其中A为峰面积，ρ为质量浓度(mg/L)。

表 1

双氰胺系列标准溶液质量浓度与对应的峰面积

质量浓度/(mg·L^-1)	峰面积
质量浓度/(mg·L^-1)	A₁	A₂	A₃
5.00	213 962	212 629	214 973
8.00	341 887	338 078	338 257
10.0	423 137	425 037	429 689
20.0	856 133	864 022	867 844
50.0	2 097 268	2 079 894	2 083 648

再对肥料样品进行6次重复测定，测定结果见表 2，双氰胺质量分数的平均值为0.168%。

表 2

稳定性肥料中双氰胺含量测定结果

测定次数	峰面积	ρ(双氰胺)/(mg·L^-1)		称样量/g	w(双氰胺)/%
测定次数	峰面积	测定值	平均值	称样量/g	w(双氰胺)/%
1	738 378	17.461 43
	718 326	16.979 63	17.140 2	0.996 8	0.172
	718 326	16.979 63
2	729 259	17.242 32
	736 454	17.415 20	17.181 9	1.016 8	0.169
	714 520	16.888 18
3	680 332	16.066 72
	682 992	16.130 64	16.131 8	0.957 6	0.168
	685 799	16.198 08
4	695 211	16.424 23
	681 789	16.101 73	16.252 3	0.963 3	0.169
	687 165	16.230 90
5	766 803	18.144 42
	750 402	17.750 34	17.948 2	1.078 4	0.166
	758 708	17.949 91
6	682 054	16.108 10
	688 452	16.261 83	16.119 0	0.964 6	0.167
	677 012	15.986 95

3.2 标准不确定度分量评定

3.2.1 标准溶液引入的标准不确定度u₁

3.2.1.1

标准物质引入的标准不确定度u₁₁

根据标准物质证书的信息：双氰胺标准物质纯度为(99.2±1.0)%，按矩形分布，取 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ ，则由标准样品引入的相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

3.2.1.2

标准储备溶液配制引入的标准不确定度u₁₂

标准储备溶液配制的不确定度来源：①天平称量引入的不确定度；②试样溶液定容体积引入的不确定度。

根据《电子天平检定规程》(JJG 1036—2008)^[8]，天平称样量0.1 g时的最大允许误差为0.000 5 g，按矩形分布，相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

定容体积不确定度来源包括：容量瓶对体积的影响和温度对体积的影响。溶液配制定容体积为100 mL，根据《常用玻璃量器检定规程》(JJG 196—2006)^[9]，A级单标线100 mL容量瓶的容量允差为±0.10 mL，按矩形分布，则由容量瓶引入的相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。取水的体积膨胀系数α=2.1×10^-4/℃，假定实验室温度为(20±5) ℃，温度对溶液体积的影响为均匀分布，温度变化引入的相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

标准储备溶液配制引入的相对标准不确定度:

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

3.2.1.3

双氰胺系列标准溶液稀释引入的标准不确定度u₁₃

在双氰胺系列标准溶液配制过程中，用移液器量取标准储备溶液50、80、100、200、500 μL，分别稀释至10 mL。根据各移液器校准证书中给出的不同体积的相对误差，取其中最大值1.0%，按矩形分布，取 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ ，则由移液器引入的相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

溶液配制定容体积为10 mL，根据JJG 196—2006^[9]，A级单标线10 mL容量瓶的容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，由容量瓶引入的相对标准不确定度: $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

系列标准溶液稀释引入的相对标准不确定度:

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

3.2.1.4

标准溶液引入的相对标准不确定度

标准溶液引入的相对标准不确定度：

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

3.2.2 最小二乘法拟合标准曲线引入的标准不确定度u₂

双氰胺标准曲线是通过对系列标准溶液的测定值进行最小二乘法拟合得到的，拟合方程的斜率及截距的不确定度也将影响测定结果的不确定度^[10-11]。

按试验方法对试样溶液和双氰胺系列标准溶液分别进行3次测定，由拟合曲线求ρ₀时产生的标准不确定度u₂按式(2)和式(3)计算：

图 2

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

图 3

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

式中：A_j——标准溶液第j次测定所得峰面积；

a——拟合标准曲线的截距；

b——拟合标准曲线的斜率；

ρ_j——第j次测定的标准溶液中双氰胺的质量浓度，mg/L；

p——样品溶液的测定总次数；

n——标准溶液的测定总次数；

ρ₀——样品溶液中双氰胺的质量浓度，mg/L；

ρ——标准溶液中双氰胺质量浓度的平均值，mg/L；

ρ_i——标准溶液中双氰胺质量浓度的测定值，mg/L。

ρ₀取第1次测定质量浓度的平均值17.140 2 mg/L，UPLC法测定双氰胺含量中最小二乘法拟合标准曲线引入的不确定度为： $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

UPLC法测定双氰胺含量最小二乘法拟合标准曲线引入的相对标准不确定度：u_{rel, 2}=u₂/ρ₀=0.009 87。

3.2.3 试样制备过程引入的标准不确定度u₃

试样制备的不确定度来源：①天平称量引入的不确定度；②样品定容体积引入的不确定度。

根据JJG 1036—2008^[8]，天平称量1 g时的最大允许误差为0.000 5 g，按矩形分布，相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

试样定容体积引入的标准不确定度的评定同3.2.1.2，容量瓶引入的相对标准不确定度u_rel(V_E′)=0.000 58，温度变化引入的相对标准不确定度u_rel(V_t′)=0.000 61。

样品制备过程引入的相对标准不确定度：

$ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $

3.2.4 样品测定重复性引入的标准不确定度u₄

在重复性条件下，对同一样品进行6次重复进样分析，测定结果见表 2。针对A类不确定度，采用Bessel公式计算得双氰胺的平均质量分数w=0.168%，单个测定值w_(k)的标准偏差 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ ，本次重复测定的A类标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。A类相对标准不确定度为 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

3.2.5 合成标准不确定度

各相对标准不确定度分量统计见表 3。

表 3

相对标准不确定度分量一览表

标准不确定度分量	不确定度来源	相对标准不确定度
u_{rel, 1}	标准溶液	0.008 80
u_{rel, 2}	最小二乘法拟合标准曲线	0.009 87
u_{rel, 3}	试样制备过程	0.000 89
u_{rel, 4}	试样测定重复性	0.005 04

因为u_{rel, 1}、u_{rel, 2}、u_{rel, 3}、u_{rel, 4}彼此独立，肥料样品中双氰胺含量的合成相对标准不确定度 $ w = \frac{{\rho \times V}}{m} \times 10\;000 $ 。

测定得到稳定性肥料中双氰胺的质量分数w-=0.168%，因此合成标准不确定度u_c=u_crel×w-=0.002 4%。

取包含因子k=2，则扩展不确定度：U=u_c×k=0.005%。

稳定性肥料中双氰胺含量可表示为：0.168%±0.005%(k=2)。

4 结语

根据NY/T 2877—2015，采用UPLC法对稳定性肥料中双氰胺含量进行了测定。稳定性肥料中双氰胺的测量不确定度主要来源为标准溶液和试样测定过程中标准曲线的拟合。

ckwx 参考文献

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图 1

图 1

图 2

表 1

表 2

3.2.1.1

标准物质引入的标准不确定度u11

3.2.1.2

标准储备溶液配制引入的标准不确定度u12

3.2.1.3

双氰胺系列标准溶液稀释引入的标准不确定度u13

3.2.1.4

标准溶液引入的相对标准不确定度

图 2

图 3

表 3

标准物质引入的标准不确定度u₁₁

标准储备溶液配制引入的标准不确定度u₁₂

双氰胺系列标准溶液稀释引入的标准不确定度u₁₃