高效液相色谱法测定有机-无机复合肥料中4种抗生素的含量

Determination of the Content of Four Antibiotics in Organic-Inorganic Compound Fertilizer by HPLC

邓帆 Fan DENG , 龚宁 Ning GONG

贵州省产品质量检验检测院贵州贵阳 550014 Guizhou Institute of Products Quality Inspection and Testing, Guiyang, Guizhou 550014, China

Author notes:

Correspondence to: 龚宁(1976—)，男，大学本科，高级工程师，从事化工产品的质量检验、检测方法研究、职业危害因素现场检测及评价等工作；499757081@qq.com

摘要：

建立了高效液相色谱法测定有机-无机复合肥料中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素等4种抗生素残留的方法。有机-无机复合肥料样品经乙二胺四乙酸二钠-Mcllvaine-甲醇提取后，以EC-C₁₈色谱柱为固定相，以不同体积比的甲醇-乙腈(1+1)和0.01 mol/L草酸混合溶液为流动相进行梯度洗脱，外标法定量。结果表明：4种抗生素的质量浓度在0.1~20.0 μg/mL内与其峰面积呈线性关系，检出限为0.75~1.0 mg/kg，加标回收率为96.7%~104%，测定值的相对标准偏差为1.6%~2.7%。

关键词：

高效液相色谱法; 抗生素; 有机-无机复合肥料; 测定;

Abstract：

A method for determination of four antibiotic residues in organic-inorganic compound fertilizer, including oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, and doxycycline, by high performance liquid chromatography(HPLC) is established. The organic-inorganic compound fertilizer sample is extracted by EDTA disodium-Mcllvaine-methanol, gradient eluted with EC-C₁₈ column as stationary phase and mixed solution of methanol-acetonitrile (1 + 1) and 0.01 mol/L oxalic acid in different volume ratios as mobile phase and quantified by external standard method. The results show that the mass concentrations of the 4 antibiotics have linear relationship with their peak areas within 0.1-20.0 μg/mL, the detection limit is 0.75-1.0 mg/kg, the recovery rate is 96.7%-104%, and the relative standard deviation of measured values is 1.6%-2.7%.

Keyword：

high performance liquid chromatography; antibiotic; organic-inorganic compound fertilizer; determination;

为了防止畜禽在生长过程中遭受病毒的感染，饲养场经常使用抗生素进行预防，但畜禽对抗生素不能完全吸收，无法吸收的抗生素便通过粪便排放了到自然环境中。有资料显示^[1]，有机-无机复合肥料中有机组分主要为鸡粪、猪粪、牛粪、羊粪等畜禽粪污。饲养场中常用的抗生素主要有氨基糖胺类、四环素类、氯霉素类、多肽类等。如果长期施用含抗生素的有机-无机复合肥料，将会威胁土壤、水体和农产品的质量安全；人如果长期食用含有抗生素的产品，有可能会伤害人体的血液系统、肾脏、肝脏、心脏等，还会灭杀人体正常菌群，诱发耐药菌的产生。四环素类抗生素使用广泛，检出率较高，且常同时检出多种化合物。因此，对有机-无机复合肥料中四环素类抗生素含量的精准检测，在防止污染原料的非预期使用、避免环境污染、促进有机-无机复合肥料生产和粪肥还田、确保粮食安全和提高农产品品质等方面具有重要作用。

1 试验部分

1.1 试验原理

试样中的四环素类抗生素用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)-Mcllvaine-甲醇提取液振荡，离心提取，再通过氮吹仪浓缩，经固相萃取柱净化，浓缩、定容后，用高效液相色谱法进行测定，通过与保留时间比较进行定性，外标法定量。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

抗生素混合标准储备液：1 mg/mL。

甲醇(CH₃OH)、乙腈(C₂H₃N)为色谱纯，德国默克公司；磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、EDTA(C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈)、水合草酸(C₂H₂O₄·2H₂O)、柠檬酸(C₆H₈O₇)为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

EDTA溶液：称取EDTA 37.22 g，用水定容至1 000 mL，此溶液物质的量浓度为0.1 mol/L。

Mcllvaine溶液：0.4 mol/L磷酸二氢钾溶液1 000 mL与0.2 mol/L柠檬酸溶液294 mL混合，摇匀。

EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液：移取EDTA溶液、Mcllvaine溶液、甲醇按体积比1∶1∶2混合，用氢氧化钠或盐酸调节pH为中性。

1.2.2 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪，配备紫外检测器、二极管阵列检测器，安捷伦科技有限公司；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；SHA-BA型机械振荡提取仪，上海巨纳科技有限公司；Turbo Vap Lv型氮吹仪，美国Caliper公司。

1.3 标准溶液系列的配制

标准溶液：移取1 mg/mL的4种抗生素混合标准储备溶液10.00 mL定容至100 mL，配成质量浓度为100 μg/mL的标准溶液。

标准溶液系列：移取标准溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mL至100 mL容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液定容，摇匀，配成质量浓度分别为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的标准溶液系列。

1.4 样品的制备

1.4.1 目标物的提取

准确称取1~2 g(精确至0.1 mg)样品于50 mL棕色离心管中，加入EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液20 mL，于机械振荡提取仪提取20 min(室温，约25 ℃)，将离心管取出置于离心机上，以转速4 500 r/min离心10 min，离心后将上层溶液转移至50 mL容量瓶中；离心管中残渣依次用20、10 mL EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液重复上述步骤提取2次, 合并上清液并定容至50 mL，待净化处理。

1.4.2 固相萃取装置净化

准确移取上清液5.00 mL置于氮吹仪上，室温(约25 ℃)吹至原体积的一半左右；加适量水稀释至体积约5 mL，以1 mL/min的速率通过已活化处理的固相萃取柱，依次用5 mL水、5 mL甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱，减压抽干5 min；用5 mL草酸-甲醇溶液洗脱目标物，洗脱液用饱和NaOH溶液调至pH为5~6，置于氮吹仪吹至近干；用1 mL水溶解残渣，过0.22 μm的滤膜，待测^[2]。

1.5 色谱条件

色谱柱：EC-C₁₈柱，2.7 μm，3.0 mm×50 mm。

流速：0.8 mL/min。

柱温：色谱柱左右两端温度均为30 ℃。

进样量：20 μL。

检测波长：355 nm。

流动相A为甲醇-乙腈(1+1)溶液，流动相B为0.01 mol/L草酸溶液，梯度洗脱条件见表 1。

表 1

梯度洗脱条件

时间/min	流动相A/%	流动相B/%
8	16	84
10	30	70
16	30	70
17	16	84
25	16	84

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

按照文献[3]中流动相条件进行试验，结果表明，流动相A为甲醇-乙腈(1+1)溶液，流动相B为0.01 mol/L草酸溶液时，可实现色谱峰的基线分离。20 μg/mL的4种抗生素混合标准溶液的色谱图见图 1。

图 1

4种抗生素混合标准溶液的色谱图

2.2 标准曲线与检出限

按色谱条件测定4种抗生素混合标准溶液系列，以抗生素的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到4种抗生素的线性回归方程和相关系数，结果见表 2。以3倍信噪比(S/N)计算4种抗生素的检出限^[4]，结果见表 2。

表 2

线性参数和检出限

抗生素	线性回归方程	相关系数	检出限/(mg·kg^-1)
土霉素	y=39.119x+3.626	0.999 9	1.0
四环素	y=48.178x-3.477	0.999 9	1.0
金霉素	y=22.796x-0.265	0.999 8	0.75
强力霉素	y=37.618x-0.396	0.999 9	1.0

由表 2可知，4种抗生素的质量浓度在0.1~20.0 μg/mL范围内呈线性，相关系数均不小于0.999 8，检出限为0.75~1.0 mg/kg。

2.3 精密度和回收试验

空白样品中添加1 mg/kg的4种抗生素混合标准溶液的色谱图见图 2。在选定的试验条件下，取已知4种抗生素含量的同一样品3份，分别添加1、5、10 mg/kg的4种抗生素混合标准溶液进行加标回收试验，每个加标水平重复测定3次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表 3。

图 2

空白样品中添加1 mg/kg的4种抗生素混合标准溶液的色谱图

表 3

精密度和回收试验结果 %

抗生素	加标量1 mg/kg		加标量5 mg/kg		加标量10 mg/kg
抗生素	回收率	RSD	回收率	RSD	回收率	RSD
土霉素	96.9	1.6	98.8	2.3	99.7	2.4
四环素	104	2.5	102	2.4	101	1.7
金霉素	96.8	2.7	97.1	2.5	98.1	2.6
强力霉素	96.7	1.9	99.4	1.6	104	1.7

由表 3可知，加标回收率为96.7%~104%，RSD为1.6%~2.7%，表明方法稳定，具有较高的精密度和较好的回收率。

3 结语

试验采用EC-C₁₈色谱柱进行分离，二极管阵列检测器检测，以外标法定量，高效液相色谱法测定有机-无机复合肥料中4种抗生素的残留量。方法具有灵敏度高、准确度高、精密度好等优点，可以满足有机-无机复合肥料中4种抗生素的检测需求。

ckwx 参考文献

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全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会. 有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法: GB/T 32951—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2016.

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