原子荧光光谱法测定粮谷中的有机硒和无机硒

Determination of Organic Selenium and Inorganic Selenium in Cereal by Atomic Fluorescence Spectrometry

孙文丹 Wendan SUN , 孟强 Qiang MENG , 王景超 Jingchao WANG , 于燕萍 Yanping YU , 田静 Jing TIAN , 于军 Jun YU , 商姗姗 Shanshan SHANG , 张娟 Juan ZHANG

山东省产品质量检验研究院山东济南 250100 Shandong Institute for Product Quality Inspection, Jinan, Shandong 250100, China

Author notes:

Correspondence to: 张娟(1976—)，女，硕士，教授级高工，长期从事土壤、肥料、农药、化工等产品的质量安全监测、研发、检测方法开发及标准研制等工作；ruyue95@163.com

摘要：

建立了原子荧光光谱法测定粮谷中有机硒和无机硒含量的方法。用硝酸消化粮谷，用6 mol/L盐酸溶液控制酸度，测定总硒；以0.1 mol/L盐酸溶液提取粮谷中的无机硒，提取液用环己烷萃取后，收集水相用硝酸-高氯酸消解，用6 mol/L盐酸溶液控制酸度，测定无机硒；总硒与无机硒的差值为有机硒含量。结果表明：硒的质量浓度在30 μg/L以内与对应的荧光强度呈线性，无机硒的加标回收率为89.0%~93.8%，其测定值的相对标准偏差小于5%，方法适用于粮谷中无机硒和有机硒的测定。

关键词：

原子荧光光谱法; 有机硒; 无机硒; 粮谷;

Abstract：

A method for the determination of organic selenium and inorganic selenium in cereal by atomic fluorescence spectrometry is established. The cereal is digested with nitric acid, the acidity is controlled with 6 mol/L hydrochloric acid solution and the total selenium is determined. Inorganic selenium in cereal is extracted with 0.1 mol/L hydrochloric acid solution. After the solution is extracted with cyclohexane, the aqueous phase is collected and digested with nitric acid and perchloric acid. The acidity is controlled with 6 mol/L hydrochloric acid solution to determine inorganic selenium. The difference between total selenium and inorganic selenium is the content of organic selenium. The results show that the mass concentration of selenium under 30 μg/L is linear to corresponding fluorescence intensity. The spiked recovery of inorganic selenium is 89.0%-93.8% and the relative standard deviation of the measured value is less than 5%. This method is suitable for the determination of inorganic selenium and organic selenium in cereals.

Keyword：

atomic fluorescence spectrometry; organic selenium; inorganic selenium; cereal;

硒是人和动物生长必需的微量元素之一，适量的硒可以调节生长、增强免疫力、提高抗氧化能力等^[1]。人体一旦缺硒，会减弱组织细胞抗氧化损伤能力，影响人体细胞的分裂、繁殖、遗传及生长，进而干扰核酸、蛋白质、多糖和酶的合成及代谢^[2-4]。

人体不能自行合成硒，而且人体各器官不具有长期储存硒的功能，人体所需的硒需要通过食物来获取，因此合理提高农产品中的硒含量是十分必要的^[5]。“土壤-植物-人”食物链是人体获取硒的有效途径。农产品中的硒主要来自于土壤中的硒，而我国约有三分之二的地区存在不同程度的缺硒，其中三分之一为严重缺硒地区^[6]。这些地区的缺硒状况可以通过在土壤中增施硒肥或向作物叶面喷施含硒制剂得到改善，进而提高农产品中的硒含量。

硒在生物体内以有机硒和无机硒两种形态存在。与无机硒相比，有机硒的安全性和可利用性更高。目前在农业生产过程中，外源施硒多选用的是无机硒、富硒酵母等，其中无机硒在农产品生长过程中能否转化成有机硒及其转化程度，需要进行硒形态分析^[7-8]。因此，建立简单准确的有机硒含量测定方法十分必要。目前硒的形态分析方法主要有原子荧光光谱法^[9]、高效液相色谱法^[10]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP-MS)^[11]、电泳-电感耦合等离子体质谱法(CE-ICP-MS)^[12]等，其中原子荧光光谱法具有操作简单、干扰少、灵敏度高等特点。本文采用原子荧光光谱法对粮谷中有机硒含量的测定进行了研究。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

选取小麦、玉米和大米等3种主要粮食作物作为试验样品。样品脱粒后，除去杂物，清洗烘干，缩分至约50 g，粉碎，完全通过孔径为0.25 mm(60目)的尼龙筛，混匀贮存于聚乙烯瓶中。

硝酸(HNO₃)、高氯酸(HClO₄)、过氧化氢(H₂O₂)、氢氧化钾(KOH)，优级纯，国药集团化学试剂有限公司；盐酸(HCl)，优级纯，烟台远东精细化工有限公司；正辛醇(C₈H₁₈O)、环己烷(C₆H₁₂)、铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；硼氢化钾(KBH₄)，质量分数97%，国药集团化学试剂有限公司；硒标准溶液，1 000 μg/mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心；硒标准工作溶液，1 μg/mL；硒代蛋氨酸溶液标准物质，上海安谱实验科技股份有限公司。

硼氢化钾溶液(8 g/L)：称取8 g硼氢化钾，溶于1 000 mL氢氧化钾溶液(5 g/L)中，混匀，现用现配。

铁氰化钾溶液(100 g/L)：称取10 g铁氰化钾，溶于100 mL水中，混匀。

硝酸-高氯酸(9+1)混合酸：将900 mL硝酸与100 mL高氯酸混匀。

1.2 仪器与设备

AFS-9760型双道原子荧光光度计，北京海光仪器公司；MARS6型微波消解仪，美国CEM公司；BSA224S型电子天平，瑞士Sartorius公司；SP-1005型零污染制样破碎机，天津拓至明实验仪器技术开发有限公司；SHY-2A型恒温水浴振荡器，上海梅香仪器有限公司；HC-3018型离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DR-600型数显恒温电热板，北京盈安美诚科学仪器有限公司。

1.3 仪器测定条件

负高压：300 V；灯电流：80 mA；原子化温度：800 ℃；炉高：8 mm；载气流量：500 mL/min；屏蔽气流量：1 000 mL/min；测量方式：标准曲线法；读数方式：峰面积；延迟时间：1 s；读数时间：15 s；加液时间：8 s；进样体积：2 mL。

1.4 测定方法

1.4.1 总硒的测定

称取0.500 0 g试样，置于消解罐中，加5 mL硝酸，振摇混合均匀，放入微波消解仪中消化。消解结束，待冷却后，将消解液转入锥形瓶中，加几粒玻璃珠，在电热板上继续加热至近干。再加6 mol/L盐酸溶液5 mL，继续加热至溶液变清亮，冷却，转移至10 mL容量瓶中，加入100 g/L铁氰化钾溶液1 mL，用水定容，混匀待测。同时做空白试验。

1.4.2 无机硒的测定

称取1.000 0 g试样于50 mL离心管中，加入0.1 mol/L盐酸溶液20 mL，混匀静置8~12 h，置于70 ℃的恒温水浴振荡器中，以160 r/min振荡2 h。提取完毕，冷却至室温后，以8 000 r/min转速离心15 min，取上层清液。将收集的上清液转移至分液漏斗中，加入环己烷5 mL萃取。收集水相于烧杯中，在70 ℃水浴上蒸发至5~10 mL。然后加入硝酸-高氯酸混合酸10 mL及几粒玻璃珠，在电热板上加热至清亮无色并有白烟出现。冷却，加6 mol/L盐酸溶液5 mL，再置于电热板上加热沸腾几分钟后取下。冷却后转移至25 mL容量瓶中，加入100 g/L铁氰化钾溶液1 mL，用水定容，混匀待测。同时做空白试验。

1.4.3 有机硒含量的计算

有机硒含量为总硒含量与无机硒含量的差值。

1.5 工作曲线

移取一系列硒标准工作溶液至100 mL容量瓶中，分别加入100 g/L铁氰化钾溶液10 mL，用盐酸(5+95)溶液定容，配制成质量浓度为0、1.00、5.00、10.0、20.0、30.0 μg/L的系列工作溶液。

2 结果与讨论

2.1 无机硒样品前处理方法的选择

2.1.1 提取剂

生物体内的无机硒主要以硒酸盐和亚硒酸盐的形式存在，有机硒以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子化合物以及硒代氨基酸等小分子化合物形式存在^[13]。测定无机硒常用的提取剂主要有水^[14]、酸^[15]和乙醇^[16]等，其中稀酸为良好的硒提取剂，通常首选盐酸体系。

考察了不同浓度的盐酸溶液对小麦中无机硒提取的影响，结果见表 1。

表 1

盐酸浓度对无机硒提取的影响

盐酸浓度/ (mol·L^-1)	无机硒测定值/ (mg·kg^-1)	盐酸浓度/ (mol·L^-1)	无机硒测定值/ (mg·kg^-1)
0.05	0.057	1.0	0.084
0.1	0.064	3.0	0.123
0.3	0.063	6.0	0.151
0.5	0.067

由表 1可知：当盐酸溶液浓度小于0.1 mol/L时，无机硒的测定值随盐酸溶液浓度的升高而增大，其原因是随着盐酸溶液浓度的升高，无机硒逐渐被溶解出来；当盐酸溶液浓度增大至0.5 mol/L时，无机硒的测定值基本不变，说明在稀酸条件下，无机硒可以完全溶出；但继续升高盐酸溶液浓度，无机硒的测定值有大幅增加，其原因可能是酸浓度过高，有机硒的结构遭到破坏后溶解出来，影响了无机硒的测定。因此，试验选用0.1 mol/L的盐酸溶液作为提取剂。

2.1.2 提取温度和提取时间

考察了温度和时间对小麦中无机硒提取的影响，结果见表 2和表 3。

表 2

温度对无机硒提取的影响

水浴温度/℃	时间/h	测定值/(mg·kg^-1)
30	2	0.054
50	2	0.059
70	2	0.064
90	2	0.066

表 3

时间对无机硒提取的影响

水浴温度/℃	时间/h	测定值/(mg·kg^-1)
70	1	0.051
70	2	0.064
70	3	0.067
70	4	0.068

结果表明：70 ℃下提取2 h，无机硒的测定值较高；随着提取温度的升高和提取时间的延长，无机硒的测定值增加不明显。因此，试验选取提取温度为70 ℃，提取时间为2 h。

2.1.3 可溶性淀粉类物质

杂粮中的可溶性淀粉类物质会对硒元素的检测产生干扰。在无机硒的提取过程中，杂粮中的可溶性淀粉类物质会溶出，导致无机硒提取液的成分复杂。当直接测试提取液时，硒的荧光信号为0。这是因为提取液中的物质与还原剂反应产生大量泡沫，影响了氢化物的传输。

据文献报道，消泡剂可以破坏和抑制泡沫薄膜的产生，选用正辛醇作为消泡剂可抑制大量泡沫，解决大量泡沫影响荧光测定的问题^[17]。试验考察了在5 μg/L硒标准工作溶液中正辛醇对硒荧光强度的影响，结果见表 4。

表 4

正辛醇对无机硒测定的影响

样品	本底值/(μg·L^-1)	测定值/(μg·L^-1)
未加入正辛醇	5.00	5.04
加入3滴正辛醇	5.00	4.67

由表 4可知，加入3滴正丁醇的硒标准工作溶液的测定值降低，这说明消泡剂在一定程度上会减弱硒的荧光信号，使测定结果偏低。

加大正辛醇的用量后，泡沫消失，但硒标准工作溶液的荧光强度降为零，说明加入消泡剂不能有效解决可溶性淀粉类物质对硒含量测定的影响。试验采用将提取液消解后再进行测定的方法，得到了准确可靠的测定数据。

2.1.4 小分子有机硒的分离

用稀盐酸提取粮谷中无机硒的同时也会将部分小分子有机硒提取出来。研究表明，水相中的小分子有机硒经甲苯^[18]、环己烷^[19]等有机溶剂的萃取，可以与无机硒有效分离。考虑到试验的安全性，采用环己烷萃取分离提取液中的小分子有机硒。选用小分子有机硒标准物质硒代蛋氨酸进行验证。

配制一定浓度的硒代蛋氨酸溶液，按试验方法进行无机硒的测定。结果表明：使用环己烷萃取分离得到的水相提取液中未检测出硒元素；未使用环己烷萃取分离的上层水相清液，硒的回收率为93.1%。说明环己烷能有效萃取分离小分子有机硒和无机硒。

2.2 工作曲线及检出限

在相同试验条件下，对0~30.0 μg/L的硒系列工作溶液进行测定，硒的线性回归方程为I_f=279.463ρ+13.161，相关系数大于0.999。对样品空白溶液连续测定11次，按3倍标准偏差计算方法的检出限为0.1 μg/L。按称样量1 g、定容体积25 mL，计算无机硒的检出限为0.003 mg/kg。

2.3 方法的精密度与回收率

2.3.1 精密度试验

对小麦、大米、玉米等样品中的无机硒进行测定，每个样品平行测定6次，计算方法的精密度，结果见表 5。

表 5

精密度试验结果

样品	测定值/(mg·kg^-1)						相对标准偏差/%
样品	1	2	3	4	5	6	相对标准偏差/%
小麦	0.063	0.065	0.064	0.063	0.061	0.067	3.20
大米	0.052	0.051	0.056	0.050	0.050	0.055	4.93
玉米	未检出

从表 5可以看出：玉米样品中的无机硒含量较低，未检出；小麦和大米样品中无机硒测定值的相对标准偏差分别为3.20%和4.93%，说明试验方法具有良好的重复性，可用于粮谷中无机硒含量的测定。

2.3.2 回收试验

对小麦、大米、玉米等样品进行加标回收试验。分别向样品中加入0.200、0.500 mg/kg硒标准溶液，每个样品平行测定2次，取2次结果的平均值作为测定值，结果见表 6。

表 6

加标回收试验结果

样品	本底值/ (mg·kg^-1)	加标量/ (mg·kg^-1)	测定总量/ (mg·kg^-1)	回收率/ %
小麦	0.064	0.200	0.242	89.0
小麦	0.064	0.500	0.515	90.2
大米	0.052	0.200	0.238	93.0
大米	0.052	0.500	0.521	93.8
玉米	未检出	0.200	0.182	91.0
玉米	未检出	0.500	0.463	92.6

从表 6可以看出，粮谷中无机硒的加标回收率为89.0%~93.8%，说明试验方法的准确度较高。

2.4 实际样品中有机硒的测定

有机硒含量通过总硒含量与无机硒含量的差减得到。按试验方法测定2个小麦样品、2个大米样品、2个玉米样品，结果见表 7。

表 7

各样品中总硒、无机硒、有机硒的测定结果

样品	总硒质量分数/ (mg·kg^-1)	无机硒质量分数/ (mg·kg^-1)	有机硒质量分数/ (mg·kg^-1)	有机硒占总硒百分比/%
小麦-1	0.275	0.064	0.211	76.7
小麦-2	0.224	0.051	0.173	77.2
大米-1	0.028	0.004	0.024	85.7
大米-2	0.380	0.053	0.327	86.1
玉米-1	0.006	未检出
玉米-2	0.010	未检出

由表 7可以看出：小麦、大米样品中有机硒占总硒百分比分别为76.7%、77.2%、85.7%、86.1%；玉米样品中总硒含量较少，未能检出无机硒。

3 结语

本文建立了粮谷中无机硒和有机硒的测定方法，用盐酸溶液在70 ℃水浴中提取其中的无机硒，离心，然后用环己烷提纯上清液，分离得到含无机硒的水相，采用原子荧光光谱法测定总硒和无机硒含量，有机硒含量为总硒与无机硒含量的差值。本方法中无机硒的加标回收率为89.0%~93.8%，测定值的相对标准偏差小于5%，具有良好的重复性，为粮谷中无机硒和有机硒的测定提供了一种可靠的检测方法。

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