超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中莫西沙星等喹诺酮类禁用物质

Cosmetics by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

党昊星 Haoxing DANG , 曹海荣 Hairong CAO , 李晓宇 Xiaoyu LI

1 上海化工研究院有限公司上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd., Shanghai 200062, China 2 上海应用技术大学化学与环境工程学院上海 201418 School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China

Author notes:

Correspondence to: 李晓宇(1989—)，男，硕士，工程师，主要从事化妆品检测方法的开发与优化及化工品的定性定量研究；lxy@ghs.cn

摘要：

建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中莫西沙星、双氟沙星、沙拉沙星等10种喹诺酮类禁用物质的方法。采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)为固定相，甲醇-0.2%(体积分数)甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以电喷雾正离子源模式(ESI⁺)和多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。结果表明，10种喹诺酮类药物的质量浓度在5~100 g/L内与峰面积呈线性关系，相关系数为0.998 2~ 0.999 8，加标回收率为100.00%~116.43%(n=3)，相对标准偏差为1.77%~5.90%(n=6)，检出限为0.002 53~0.025 5 mg/kg，定量限为0.008 44~0.085 2 mg/kg。

关键词：

超高效液相色谱-串联质谱法; 喹诺酮; 化妆品;

Abstract：

A method for the simultaneous determination of 10 quinolones such as moxifloxacin, difloxacin, sarafloxacin in cosmetics using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is established. ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) as stationary phase, methanol-0.2% (volume fraction) formic acid solution as mobile phase is gradient eluted. Mass spectrometry is analyzed by electrospray positive ionization source (ESI⁺) mode and multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that the mass concentration of 10 quinolones has a linear relationship with the peak area in the range of 5-100 g/L, the correlation coefficient is 0.998 2-0.999 8, the recovery is 100.00%-116.43% (n = 3), the relative standard deviation is 1.77%-5.90% (n = 6), the detection limit is 0.002 53-0.025 5 mg/kg, and the quantitative limit is 0.008 44 ~ 0.085 2 mg/kg.

Keyword：

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; quinolones; cosmetics;

0 前言

喹诺酮类药物指的是人工合成的含4-喹诺酮结构的抗菌药，具有抗菌谱广、口服方便、价格低廉等特点，常见的喹诺酮类药物有莫西沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星等。由于喹诺酮类成本低，且具有一定的祛痘、除螨效果，生产厂商会在很多化妆品中添加一些喹诺酮类组分^[1]。消费者如果错用、误用或过量使用含有喹诺酮类药物的化妆品，很有可能引起过敏反应^[2]，严重时甚至有致癌的可能^[3]。有些喹诺酮类药物还被发现能使致病菌产生耐药性^[4]，不利于临床治疗。因此，我国已在《化妆品安全技术规范》(2015版)中将喹诺酮类药物列为化妆品禁用组分^[5]，研究有关化妆品中多种喹诺酮类药物同时测定的方法非常必要。

目前，检测化妆品中喹诺酮类药物的常用方法有电化学法^[6]、毛细管电泳技术^[7]、表面增强拉曼技术^[8]、高效液相色谱法^[9-11]、液相色谱-质谱联用法^[12-14]等。文献[1, 15-16]报道用液相色谱-串联质谱法或反相液相色谱法检测化妆品中多种抗生素，检测一个样品所用时间超过20 min；文献[3, 10, 12, 17]报道的方法仅针对家禽畜肉中一种或多种喹诺酮类物质的检测。由于上述检测方法普遍存在操作烦琐、耗时较长、适用范围窄等不足，因此需要建立一种简便、快速测定化妆品中多种喹诺酮类物质的方法。本文基于超高效液相色谱-串联质谱法，提出了一种同时测定化妆品中莫西沙星等10种喹诺酮类药物的分析方法，其中液相色谱-质谱联用分析方法选择性强、分辨率高、准确性好、灵敏度高^[17]，可以实现对10种喹诺酮类组分的有效分离及定性定量分析，并可应用于化妆品检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC^® H-CLASS超高效液相色谱-Xevo TQD MS三重四极杆质谱联用仪, 美国Waters公司；Simplicity超纯水纯化系统，美国Millipore公司；KUDOS科导超声波清洗器，上海科导超声仪器公司；AL204-IC型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

莫西沙星(98.00%，质量分数，下同)、双氟沙星(96.18%)、沙拉沙星(85.82%)、恩诺沙星(99.90%)、环丙沙星(92.31%)、培氟沙星(98.60%)、诺氟沙星(97.29%)、氧氟沙星(99.31%)、氟罗沙星(98.48%)、依诺沙星(95.84%)标准品，上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、甲酸，色谱纯，德国CNW Technologies。

混合标准储备溶液：称取莫西沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星标准品各10 mg(精确至0.001 g)置于50 mL烧杯中，用甲醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度并摇匀，配制成100 mg/L的混合标准储备溶液。

单标准储备溶液：称取莫西沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星标准品各10 mg(精确至0.001 g)分别置于不同的50 mL烧杯中，用甲醇溶解后转移至100 mL容量瓶中定容，摇匀，配制成100 mg/L的单标准储备溶液。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温为25 ℃，进样量为5 μL；流动相中有机相选用甲醇(A)，水相为0.2%(体积分数，下同)甲酸溶液(B)，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱程序见表 1。

表 1

梯度洗脱程序

时间/min	流动相体积分数/%
时间/min	甲醇(A)	0.2%甲酸溶液(B)
0	2	98
0.50	2	98
8.50	60	40
9.00	2	98
10.00	2	98

1.2.2 质谱条件

电喷雾正离子源(ESI⁺)模式，多反应监测(MRM)模式，干燥气温度为600 ℃，干燥气流量为900 L/h，锥孔流量为50 L/h，毛细管电压为0.50 kV。

1.3 样品前处理

称取化妆水空白样品1 g(精确至0.001 g)置于50 mL比色管中，加入2 mL饱和氯化钠溶液和2%甲酸溶液30 mL，超声5 min，加入甲醇10 mL，超声振荡15 min，静置3 min后，将上层清液进行过滤，得到的滤液作为待测样品。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

将已制备的单标准储备溶液经蠕动泵注入到离子源中进行质谱分析后，得到目标物的母离子质荷比，通过对比正、负离子模式下的响应值发现，在ESI⁺模式下，喹诺酮类物质均有较强的分子-离子峰，因此试验选用电喷雾正离子源模式。

采用ESI⁺进行二级质谱分析，通过调节碰撞能量(CE)和电压参数，选择并确定响应较好的定量离子和定性离子对，使待测物的离子化效率达到最优，同时确定最优的质谱条件。10种喹诺酮类分析物的质谱参数见表 2。

表 2

10种喹诺酮类分析物的质谱参数

组分	质荷比		锥孔电压/V	子离子的碰撞气能量/V
组分	母离子	子离子	锥孔电压/V	子离子的碰撞气能量/V
莫西沙星	402.3	384.1	46	19
双氟沙星	400.2	356.1	44	19
沙拉沙星	386.2	342.1	44	18
氟罗沙星	370.1	326.2	44	17
氧氟沙星	362.2	318.2	44	18
恩诺沙星	360.2	316.2	44	18
培氟沙星	334.2	316.1	42	23
环丙沙星	332.2	314.1	45	22
依诺沙星	321.2	303.2	44	19
诺氟沙星	320.2	302.2	42	21

2.2 流动相的选择

首先制备乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-0.2%甲酸溶液等混合溶液，分别作为流动相；将10种喹诺酮类分析物溶于甲醇和乙腈，静置摇匀后经色谱柱进行分析。结果表明，选用甲醇-0.2%甲酸溶液作为流动相时，峰形较明显，各组分的分离度较高。因此，试验选用甲醇-0.2%甲酸溶液作为流动相^[18]。

考虑到氟罗沙星、培氟沙星等10种喹诺酮类分析物相互之间存在较为明显的极性差异，选用梯度洗脱程序。在梯度洗脱条件下，10种喹诺酮类分析物的MRM色谱图见图 1。

图 1

10种喹诺酮类分析物的MRM色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系、检出限和定量限

(1) 线性关系

移取10种标准物质的混合标准储备溶液，用甲醇稀释后得到5、10、20、50、80、100 μg/L混合标准系列溶液。将混合标准系列溶液按仪器工作条件分别进样，以混合标准系列溶液的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，10种喹诺酮类禁用物质的质量浓度在5~100 μg/L内与峰面积呈线性相关，相关系数为0.998 2~0.999 8。

(2) 检出限和定量限

记录最低质量浓度待测样品的信号和空白样品信号(高度)的比值，以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算检出限L_OD和定量限L_OQ^[19]，计算公式见式(1)和式(2)：

图 1

$ {\mathit{L}_{{\rm{OD}}}} = \frac{{{C_{{\rm{min}}}}}}{{S/N}} \times 3 $

图 2

$ {\mathit{L}_{{\rm{OD}}}} = \frac{{{C_{{\rm{min}}}}}}{{S/N}} \times 3 $

式中：C_min——标准曲线中最低质量浓度；

S/N——信噪比。

计算得10种喹诺酮类禁用物质的检出限为0.002 53~0.025 5 mg/kg，定量限为0.008 44~0.085 2 mg/kg。

10种喹诺酮类禁用物质的线性范围、相关系数、检出限及定量限见表 3。

表 3

10种喹诺酮类禁用物质的线性范围、相关系数、检出限和定量限

组分	线性范围/ (μg·L^-1)	相关系数r	L_OD/ (mg·kg^-1)	L_OQ/ (mg·kg^-1)
莫西沙星	5~100	0.999 6	0.007 54	0.025 1
双氟沙星	5~100	0.999 8	0.007 90	0.026 3
沙拉沙星	5~100	0.999 7	0.01 58	0.052 6
氟罗沙星	5~100	0.999 6	0.002 53	0.008 44
氧氟沙星	5~100	0.999 4	0.010 2	0.034 0
恩诺沙星	5~100	0.999 3	0.006 96	0.023 2
培氟沙星	5~100	0.998 9	0.024 1	0.080 2
环丙沙星	5~100	0.998 4	0.025 5	0.085 2
依诺沙星	5~100	0.999 0	0.018 5	0.061 6
诺氟沙星	5~100	0.998 2	0.024 0	0.080 0

2.3.2 加标回收率

称取1 g待测样品，加入至混合标准储备溶液中，按试验方法处理后得到质量浓度分别为0、40、60、80 μg/L的4个不同样品；采用选定的仪器工作条件，每个样品进行3组平行测定，共测定12次，计算加标样品的回收率，计算公式见式(3)^[20]：

图 3

$ {\mathit{L}_{{\rm{OD}}}} = \frac{{{C_{{\rm{min}}}}}}{{S/N}} \times 3 $

式中：ρ_i——第i次测量的质量浓度；

ρ₀——待测样品的质量浓度；

ρ_s——实际加入的混合标准储备溶液的质量浓度。

以加入40 μg/L混合标准储备溶液为例，在加标回收试验过程中，空白样品的MRM色谱图和加标样品的MRM色谱图分别见图 2和图 3。

图 2

空白样品的MRM色谱图

图 3

加标样品的MRM色谱图

10种喹诺酮类禁用物质的加标回收率(见表 4)为100.00%~116.43%，说明试验方法准确度较好。

表 4

10种喹诺酮类禁用物质的加标回收率

组分	加标量/(μg·L^-1)	回收率/%		组分	加标量/(μg·L^-1)	回收率/%
组分	加标量/(μg·L^-1)	计算值	平均值	组分	加标量/(μg·L^-1)	计算值	平均值
莫西沙星	40	94.04	100.00	恩诺沙星	40	101.66	109.26
	60	101.67			60	112.92
	80	104.28			80	113.19
双氟沙星	40	95.88	107.72	培氟沙星	40	112.96	115.00
	60	113.51			60	116.21
	80	113.77			80	115.83
沙拉沙星	40	106.95	110.90	环丙沙星	40	110.07	112.44
	60	112.67			60	112.74
	80	113.08			80	114.51
氟罗沙星	40	94.56	102.13	依诺沙星	40	114.04	116.43
	60	104.58			60	116.40
	80	107.26			80	118.84
氧氟沙星	40	113.50	113.10	诺氟沙星	40	105.94	108.41
	60	113.03			60	111.82
	80	112.77			80	107.46

2.3.3 精密度

称取1 g待测样品，加入至混合标准储备溶液中，得到质量浓度为40、60、80 μg/L的3个试样；在选定的仪器工作条件下，每个样品进行6次平行测定，计算测定值的相对标准偏差(RSD)，计算公式见式(4)和式(5)^[20]：

图 4

$ {\mathit{L}_{{\rm{OD}}}} = \frac{{{C_{{\rm{min}}}}}}{{S/N}} \times 3 $

图 5

$ {\mathit{L}_{{\rm{OD}}}} = \frac{{{C_{{\rm{min}}}}}}{{S/N}} \times 3 $

式中：S——质量浓度测量值的标准偏差；

ρ_i——第i次测定的质量浓度；

ρ——n次测量质量浓度的平均值；

n——测定次数。

试验测得的10种喹诺酮类禁用物质的RSD(见表 5)为1.77%~5.90%(n=6)，小于15%，表明试验方法的精密度较好。

表 5

10种喹诺酮类禁用物质的精密度(n=6)

组分	加标量/(μg·L^-1)	RSD/%		组分	加标量/(μg·L^-1)	RSD/%
组分	加标量/(μg·L^-1)	计算值	平均值	组分	加标量/(μg·L^-1)	计算值	平均值
莫西沙星	40	5.43	3.06	恩诺沙星	40	2.51	1.77
	60	1.68			60	1.34
	80	2.06			80	1.47
双氟沙星	40	10.75	5.55	培氟沙星	40	5.51	2.69
	60	3.61			60	1.64
	80	2.28			80	0.93
沙拉沙星	40	3.66	4.77	环丙沙星	40	3.92	5.90
	60	4.42			60	7.72
	80	6.23			80	6.05
氟罗沙星	40	9.78	4.18	依诺沙星	40	4.87	5.36
	60	1.80			60	5.83
	80	0.95			80	5.39
氧氟沙星	40	1.56	2.97	诺氟沙星	40	4.29	3.49
	60	5.67			60	1.52
	80	1.69			80	4.66

3 结语

本文提出了一种同时测定化妆品中莫西沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星等10种喹诺酮类禁用物质的超高效液相色谱-串联质谱法。方法简便快捷、耗时较短，标准曲线的相关系数为0.998 2~0.999 8，10种物质的检出限为0.002 53~0.025 5 mg/kg，定量限为0.008 44~ 0.085 2 mg/kg，加标回收率为100.00%~116.43%，精密度平均值小于15%，表明所提出方法的灵敏度较高、准确性较好、可重复性较好，可快速测定化妆品中多种喹诺酮类药物，以期为化妆品中禁用物质的检测提供技术支持。

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