花生接种胶冻样类芽孢杆菌对土壤微生物群落、氨化细菌、固氮菌及产量的影响

Effects of Peanut Inoculated with <i>Paenibacillus mucilaginosus</i> on Soil Microbial Community, Ammonifying Bacteria, Azotobacter and Yield

张爱民 Aimin ZHANG , 甄丽娜 Lina ZHEN , 徐业营 Yeying XU , 张双凤 Shuangfeng ZHANG , 张璐琳 Lulin ZHANG

1 河北大学生物技术研究中心河北保定 071051 Research Center of Biological Technology, Hebei University, Baoding, Hebei 071051, China 2 博野县农业农村和水利局河北保定 071300 Agricultural, Rural and Water Conservancy Bureau of Boye County, Baoding, Hebei 071300, China 3 河北邢化生态环境工程有限公司河北宁晋 055550 Hebei Xinghua Ecological Environment Engineering Co., Ltd., Ningjin, Hebei 055550, China

Author notes:

Correspondence to: 张璐林(1993—)，女，研究实习员，主要从事土壤微生物菌剂的科研及生产工作；546114737@qq.com

摘要：

针对花生连作对花生生长和产量的不利影响，通过田间小区试验，研究了花生接种胶冻样类芽孢杆菌后土壤中的细菌、放线菌和真菌，尤其是根际氨化细菌和固氮菌的的数量变化，同时分析了胶冻样类芽孢杆菌对花生生育性状及产量的影响。结果表明：土壤中细菌、放线菌、真菌的数量随着花生生育期的延长，呈下降趋势；随着胶冻样类芽孢杆菌接种数量的增加，在花生不同生育期土壤中细菌和放线菌的数量有不同程度的提高，而真菌数量下降；未接种胶冻样类芽孢杆菌的花生在苗期和开花期无法检出氨化细菌和固氮菌，施用胶冻样类芽孢杆菌400 g/亩(1亩=667 m²)的处理在整个花生生育期都可检出；花生的株高、侧枝长度及产量均呈现随胶冻样类芽孢杆菌施用量的增加而递增的趋势，说明接种胶冻样类芽孢杆菌后不仅可减少施肥量，而且可提高花生产量，增产增收效益明显。

关键词：

花生; 连作; 胶冻样类芽孢杆菌; 微生物群落; 固氮菌; 氨化细菌; 产量;

Abstract：

In connection with the adverse effects of continuous cropping of peanuts on the growth and yield of peanuts, through a field plot experiment, the quantitative changes of bacteria, actinomycete and fungi, especially the rhizosphere ammonifying bacteria and azotobacter in the soil after peanuts inoculated with Paenibacillus mucilaginosus are studied, at the same time, the effects of Paenibacillus mucilaginosus on peanut growing characters and yield are analyzed. The results show that the number of bacteria, actinomycetes and fungi in soil decreases with the extension of peanut growth period. With the increase in the number of inoculated Paenibacillus mucilaginosus, the number of bacteria and actinomycetes in the soil at different growth stages of peanuts increases to varying degrees and the number of fungi decreases. Ammonifying bacteria and nitrogen fixing bacteria have not been detected in peanuts not inoculated with Paenibacillus mucilaginosus at seedling stage and flowering stage, but can be detected during the entire growth period of peanuts treated with Paenibacillus mucilaginosus at 400 g/mu(1 mu=667 m²). The plant height, lateral branch length and yield of peanuts all show an increasing trend with the increase of the application amount of Paenibacillus mucilaginosus, indicating that the inoculation of Paenibacillus mucilaginosus can not only reduce the amount of fertilizer, but also increase the yield of peanuts, which has significant effects of increasing yield and increasing earnings.

Keyword：

peanut; continuous cropping; Paenibacillus mucilaginosus; microbial community; azotobacter; ammonifying bacteria; yield;

0 前言

花生是全球种植较广泛、用途多样的油料和蛋白作物，也是我国高商品率的主要经济作物和特色出口农作物，综合加工利用增值明显，是促进农业可持续发展的主导作物之一。花生生产对维持我国油脂和蛋白质的供需平衡，保持社会经济的健康发展具有重要的现实意义^[1]。

河北省花生年均播种面积近650万亩，总产量1 400 kt，分别占省内油料作物的70%和90%以上，是河北省第一大油料作物，播种面积和总产量均占全国花生的10%。由于多年连作，土壤生物肥力下降，土传病害严重，根际微生物代谢紊乱，直接抑制根的营养吸收和生长，同时也影响根围土壤中的物质转化，从而在很大程度上影响花生的生长和产量，研究种植区域接种功能微生物对微生物群系的变化和花生产量的提高具有重要的意义^[2]。

胶冻样类芽孢杆菌K-9菌株是河北大学从河北省高阳县玉米根际土壤中分离筛选出的土著微生物菌株，是一种能分解磷钾矿物的细菌，还具有分解土壤中硅酸盐、铝酸盐及云母等矿物质，释放钾、硅、磷等多种营养元素供作物吸收利用，增加作物产量的作用。该菌株作为我国生物肥料生产的一类重要功能菌，用于转化利用土壤中的矿物质元素等资源，已在国内众多微生物肥料生产企业中得到应用，对于发展生态、经济农业具有十分重要的意义^[3-4]。

本研究以胶冻样类芽孢杆菌K-9菌株为出发菌株研制的菌粉为接种剂进行花生接种试验，分析在花生不同生育期根际土壤中细菌、放线菌、真菌等三大类微生物数量的变化，重点研究了与土壤氮素相关的氨化细菌及固氮菌数量的变化，在分析影响接种后花生产量的基础上，探索出了提高花生产量的施肥措施。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验地点概况

试验地点选在河北省河间市冀宇农业专业合作社的花生地，位于北纬38°28″、东经116°24″，海拔高度12.1 m，雨季主要集中在7—8月，年降雨量450~900 mm，属于温带半湿润季风气候区。供试土壤为沙壤土，试验前0~20 cm土层的基本理化性状见表 1。

表 1

供试土壤基本理化性状

pH	w(有机质)/ (g·kg^-1)	w(碱解氮)/ (mg·kg^-1)	w(速效磷)/ (mg·kg^-1)	w(速效钾)/ (mg·kg^-1)
7.4	8.0	289.46	40.0	172.7

1.1.2 试验肥料

过磷酸钙，w(P₂O₅)≥12%，湖北程瑞化学有限公司；尿素，w(N)≥46%，沧州大化集团有限公司；磷酸氢二铵，N-P₂O₅-K₂O=18-46-0，什邡志信化工有限公司；硫酸钾，w(K₂O)≥50%，济南邦瑞化工有限公司；胶冻样类芽孢杆菌K-9菌株菌粉(100亿/g，以下简称菌粉)，河北大学生物技术研究中心生态与环保实验室研制。

1.1.3 作物

花生：冀农08-12，河北农业大学农学院国家花生协作组提供。

1.1.4 培养基

细菌检测培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7.2~7.4。

放线菌检测培养基(改良高氏1号培养基)：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20.0 g，蒸馏水l 000 mL，pH为7.2~7.4。

真菌检测培养基(马丁氏培养基)：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，琼脂20.0 g，10 g/L孟加拉红溶液3.3 mL，硫酸镁0.5 g，自来水1 000 mL，pH为7.0~7.4；使用前每l00 mL培养基中加1 g/L链霉素0.3 mL。

固氮菌检测培养基(无氮培养基)：磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5.0 g，葡萄糖或甘露醇10.0 g，蒸馏水l 000 mL，pH为7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

花生种植时间为2019年4月24日，收获日期为9月26日，生育期125 d。采用随机区组设计，设4个处理，以A₁处理为对照，每个处理重复3次，试验各处理的肥料用量见表 2。小区面积为7.5 m²，采用地膜覆盖种植模式，人工点种，种植密度18 000株/亩。肥料施用方法为底施，即将各种肥料混合均匀后撒施在小区中，然后翻耕定植花生。整个生育期浇水4次、除草2次。

表 2

试验各处理的肥料用量 g/亩

处理	尿素	磷酸氢二铵	过磷酸钙	硫酸钾	菌粉
A₁	5 000	20 000	40 000	6 000	0
A₂	5 000	20 000	35 000	5 000	200
A₃	5 000	20 000	30 000	4 000	300
A₄	5 000	20 000	20 000	3 000	400

1.2.2 土壤样品采集

在花生出苗期、开花期、结荚期和收获期进行土样采集。采用5点取样法采集土样，土层深度为5~20 cm，采集后剔除土样中的杂物，破碎大土块，置于通风条件下自然风干，风干后的土壤样品用研钵磨碎，过1 mm筛子后用塑封袋封闭，于4 ℃下保存待测。

1.2.3 土壤微生物的测定

细菌、放线菌和真菌采用平板稀释法^[5]进行测定，细菌测定选用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌测定选用马丁氏培养基，放线菌测定选用改良高氏1号培养基。

采用最大可能数(MPN)法测定土壤样品中的氨化细菌，采用无氮培养基法测定固氮菌。

1.2.4 花生收获期生育性状及产量的测定

在花生收获期，分别取A₁、A₂、A₃、A₄等4个处理的10穴花生进行株高、侧枝长度的测量及荚果数和产量的测定，其中株高和侧枝长度采用米尺测量，花生风干后采用FA1004型天平(上海衡平仪器厂)称量其质量，并采用SPASS软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同施肥处理对土壤中细菌、放线菌和真菌数量的影响

分别在花生苗期、开花期和结荚期，通过平板稀释法，选用不同的培养基对土壤中的细菌、放线菌和真菌数量进行3次平行测定，测定结果的平均值见表 3。

表 3

花生不同生育期土壤中细菌、放线菌和真菌数量测定结果的平均值

生育期	处理	细菌/ (×10⁸ cfu·g^-1)	放线菌/ (×10⁶ cfu·g^-1)	真菌/ (×10⁶ cfu·g^-1)
苗期	A₁	8.45	1.67	1.456
	A₂	8.78	1.86	1.467
	A₃	9.34	1.78	1.435
	A₄	9.89	1.79	1.458
开花期	A₁	8.32	2.25	1.387
	A₂	8.85	2.45	1.267
	A₃	9.56	2.56	1.221
	A₄	10.45	2.67	1.245
结荚期	A₁	8.21	2.05	1.334
	A₂	8.43	2.35	1.289
	A₃	9.34	2.34	1.234
	A₄	9.67	2.24	1.239

从表 3可以看出，土壤中细菌数量最多，达到10⁸数量级；放线菌数量次之，为10⁶数量级；真菌数量最少。

花生生育期从苗期到开花期，细菌的繁殖呈现上升趋势，到结荚期则出现下降。施用胶冻样类芽孢杆菌处理的细菌数量与A₁处理的相比均有不同程度的增加，其中A₄处理的在苗期增加17.0%，开花期达到最大为25.6%，到结荚期又略有下降。放线菌数量的变化与细菌的相同，与A₁处理的相比，A₄处理的放线菌数量在苗期增加7.2%，开花期达到最大为18.7%，到结荚期又略有下降。土壤中的真菌与细菌、放线菌不同，随花生生育期的延长，3个时期的真菌数量均表现出A₂＞A₄＞A₃，A₃处理的真菌数量最少，可能与胶冻样类芽孢杆菌对土壤病原微生物具有抑制作用有关，而土壤中的致病微生物大多为真菌^[6-7]。

2.2 不同施肥处理对土壤固氮菌和氨化细菌数量的影响

在花生的不同生育期采集土样，通过平板稀释法，采用氨化细菌的检测方法对土壤中的氨化细菌数量进行分析，同时选用固氮菌培养基对土壤中固氮菌数量进行测定，结果见表 4(其中“+”表示可检测出，“－”表示未检出)和表 5。

表 4

花生不同生育期土壤中氨化细菌测定结果

处理	数量级	苗期	开花期	结荚期	收获期
A₁	×10⁷	－	－	+	-
A₂	×10⁷	－	+	+	+
A₃	×10⁷	－	+	+	+
A₄	×10⁷	+	+	+	+

表 5

花生不同生育期土壤中固氮菌测定结果 cfu/g

处理	苗期	开花期	结荚期	收获期
A₁	0	0	2.03×10⁶	未测定
A₂	1.05×10⁶	1.97×10⁶	3.00×10⁶	未测定
A₃	1.59×10⁶	2.27×10⁶	3.51×10⁶	未测定
A₄	2.13×10⁶	3.00×10⁶	4.50×10⁶	未测定

氨化作用在土壤氮素矿化中起到了决定性作用，其强度的变化在一定程度上反映了土壤供氮能力^[8-9]。由表 4可知，花生在苗期和开花期，A₁处理检测不出氨化细菌，到花生结荚期可以检测出氨化细菌；而A₄处理从花生苗期到收获期，均可检测出氨化细菌，可能是菌粉接种量大，诱导了土壤中氨化细菌的活动，机理还有待研究。由于氨化细菌检测只进行了定性分析，无定量的比较，所以各处理间无法进行数量的统计。

由表 5可知，土壤中固氮菌的变化与氨化细菌基本一致，证实了花生接种胶冻样类芽孢杆菌可以诱导土壤中有益固氮菌的活动。A₁处理与A₄处理比较，在结荚期固氮菌数量由2.03×10⁶ cfu/g增至4.50×10⁶ cfu/g，增加了121.7%，固氮菌数量的提高为作物氮素的供给起了积极作用。由于生物固氮是通过固氮原核微生物体内的固氮酶系统，将大气中的N₂催化转化为植物可利用的NH₄⁺，每年可为农田生态系统提供氮素40~70 kg/亩，所以固氮菌的固氮作用是农业生态系统中氮素的重要来源之一^[10-11]。

2.3 收获期花生生育性状调查及考种

花生收获时，首先在A₁、A₂、A₃、A₄ 等4个处理中选取相同的位置取10穴花生，进行产量测定，同时进行考种，然后通过SPASS软件进行数理统计分析。不同施肥处理的花生生育性状及产量测定结果见表 6。

表 6

不同施肥处理的花生生育性状及产量测定结果

处理	株高/cm		侧枝长度/cm		单株荚果数/个		产量/(kg·亩^-1)
处理	测定值	平均值	测定值	平均值	测定值	平均值	测定值	平均值
A₁	61.7		106.0		22.0		320.0	379.1
	49.5	54.8	89.2	97.8	20.0	21.3	400.0
	53.3		98.3		22.0		417.4
A₂	54.3		101.0		23.0		413.8	408.9
	62.3	57.1	109.0	98.7	22.0	21.3	400.0
	54.8		86.2		19.0		412.9
A₃	62.7		112.0		23.0		388.6	416.0
	54.7	57.6	84.3	98.3	18.0	20.7	294.7
	55.3		98.7		21.0		564.7
A₄	50.3		109.7		19.0		492.3	425.5
	59.3	58.8	98.3	99.2	23.0	20.7	419.1
	66.7		89.5		20.0		365.2

由表 6可知，A₁、A₂和A₄处理的花生株高、侧枝长度和产量均呈现递增趋势，A₃处理的侧枝长度略短，A₄表现最好，4个处理的花生单株荚果数基本无差异。进一步通过SPASS软件进行花生株高、侧枝长度、单株荚果数及产量的显著性分析，差异显著性(P_显著性)依次为0.838、0.990、0.172、0.902，均大于P(P=0.05)，说明处理间无显著性差异，表明通过减少过磷酸钙及硫酸钾的用量、增加菌粉的用量可以达到花生增产的效果。亩施菌粉200 g同时每亩减少5 kg过磷酸钙和1 kg硫酸钾用量的A₂处理的花生产量与A₁处理的相比，无显著差异，说明亩施菌粉200 g与亩施5 kg过磷酸钙和1 kg硫酸钾具有等效性。进一步提高菌粉接种量同时减少化肥用量，A₄处理的花生产量与A₁处理的相比增产46.4 kg，进一步证明了施用胶冻样类芽孢杆菌具有增产效果，可减少化肥用量。

2.4 经济效益分析

花生收获后，按尿素2 650元/t、磷酸氢二铵3 600元/t、过磷酸钙700元/t、硫酸钾4 250元/t、花生4.4元/kg、菌粉40元/kg计，进行经济效益分析，结果见表 7。

表 7

经济效益分析一览表

处理	亩产量/ kg	增产量/ (kg·亩^-1)	新增产值/ (元·亩^-1)	化肥成本/ (元·亩^-1)	菌粉成本/ (元·亩^-1)	肥料成本变动/ (元·亩^-1)	新增纯利润/ (元·亩^-1)
A₁	379.1			138.75	0
A₂	408.9	29.8	131.12	131.00	8.0	0.25	130.87
A₃	416.0	36.9	162.36	123.25	12.0	-3.50	165.86
A₄	425.5	46.4	204.16	112.00	16.0	-10.75	214.91

由表 7可知：A₂、A₃、A₄处理与A₁处理比较，亩新增纯利润分别为130.87、165.86、214.91元，表明逐渐减少化肥用量的同时增加菌粉用量，亩产量和产值呈上升趋势；A₄处理表现最佳，与A₁处理相比，花生产量提高了12.24%，纯利润增加了214.91元/亩；施用菌粉可以作为花生减施化肥的基本措施，即亩施用菌粉400 g，在不减少尿素及磷酸二铵用量的前提下，过磷酸钙和硫酸钾的用量减少50%，可以达到理想的增产效果。

3 结语

本研究表明，胶冻样类芽孢杆菌作为花生接种剂对于减少化肥用量、提高花生产量具有一定的积极作用。由于试验地块单一，胶冻样类芽孢杆菌的大田应用试验效果有待进一步验证，其对根际有益菌群增加的机理也有待进一步研究。

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