乳品中常见过敏原特征多肽的筛查及制备应用

Screening, Preparation and Application of Characteristic Polypeptide of Common Allergens in Dairy Products

雷雯 Wen LEI , 徐增益 Zengyi XU , 陈燕秋 Yanqiu CHEN

上海化工研究院有限公司/上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd./Shanghai Professional Technical Service Platform for Detection and Application Development of Stable Isotope, Shanghai 200062, China

摘要：

β-乳球蛋白是乳品中主要的过敏原物质，乳品过敏主要见于婴幼儿，严重时可能出现生命危险，是影响人体健康安全的主要因素之一。利用蛋白质组学数据库UniProt、酶解模拟软件Skyline、试验验证，对过敏原β-乳球蛋白的特征多肽进行筛查，筛选出1条稳定性强、抗干扰性能优越的多肽IDALNENK，并制备合成了¹³C、¹⁵N标记的IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)作为β-乳球蛋白的内标物。采用同位素稀释质谱法检测乳品中过敏原时将上述特征多肽作为内标物，可以准确定量乳品中β-乳球蛋白的含量，且灵敏度较高。

关键词：

过敏原; 特征多肽; β-乳球蛋白; 固相合成;

Abstract：

β-Lactoglobulin is the main allergen in dairy products. Dairy allergy is mainly seen in infants and young children and in severe cases may be life-threatening as well as being one of the main factors affecting human health and safety. Using proteomic database Uniprot, enzymatic hydrolysis simulation software Skyline and experimental verification, the characteristic polypeptides of the allergen β-lactoglobulin are screened.A polypeptide IDALNENK with high stability and superior interference resistance is screened, and ¹³C, ¹⁵N-labeled IDAL*NENK (¹³C₆, ¹⁵N-Leu) is prepared and synthesized as a internal standard substance polypeptide for β-lactoglobulin. When using isotope dilution mass spectrometry to detect allergens in dairy products, the above characteristic polypeptide can be used as internal standard to accurately quantify β-lactoglobulin content in dairy products and with high sensitivity.

Keyword：

allergen; characteristic polypeptide; β-lactoglobulin; solid phase synthesis;

乳和乳制品是人体重要的蛋白质来源，是营养健康的重要保证，其中乳蛋白是最有营养价值的部分，包括乳清等物质^[1-4]。β-乳球蛋白是乳清中的主要蛋白质，基本存在于所有牛类的乳汁中，也是市售乳品中的一种物质，其在牛奶中含量较高，占奶类中所有蛋白质的7%~12%^[5-7]。但β-乳球蛋白又是乳品中主要的过敏原，其次为α-乳球蛋白^[8]。β-乳球蛋白在牛科动物中属于免疫球蛋白，在大量动物体试验中发现，β-乳球蛋白的水解物质或某些片段能够起到降胆固醇和抗氧化的作用。不过，该物质对于婴幼儿却是“威胁”。经统计，β-乳球蛋白极易导致婴幼儿出现过敏症状，因为婴幼儿消化系统发育不完全，β-乳球蛋白一进入婴幼儿体内就会被判定为病原，从而诱发免疫反应。此外，影响牛乳及乳蛋白的因素有很多，产地、土壤元素含量等都能对饲草造成影响，进而对牛乳及乳蛋白造成差异^[9-10]，因此开展有关β-乳球蛋白检测方法的研究是行业的迫切需要^[11-14]，更是对婴幼儿健康的保证。

目前，针对食品过敏还未研究出特效疗法，乳品过敏患者只能谨慎防止摄入含有过敏原的食品。国外针对乳品过敏原β-乳球蛋白的准确定量已有了一定的研究^{[13, 15-16]}，但国内还鲜有报道。本文主要对过敏原β-乳球蛋白的特征肽段进行初步筛查，筛选出较为稳定的IDALNENK作为特征多肽，并制备出内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)，可应用在市场上常见乳品中β-乳球蛋白的检测。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LCMS-2020型液相色谱质谱联用仪，日本Shimadzu公司；Milli-Q型纯水机，德国Merck公司；1 000 μL移液枪、XP205型分析天平，瑞士梅特勒公司；TGL-16aR型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；冰箱、热鼓风恒温仪，上海一恒科学仪器有限公司。

胰蛋白酶和β-乳球蛋白(质量分数≥90%)标准品，美国SIGMA公司；碳酸氢铵、碘乙酰胺、二硫苏糖醇、甲酸(色谱级)、乙腈(色谱级)，国药集团上海有限公司。

β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK和内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)均由上海化工研究院有限公司合成；纯牛奶购自超市。

1.2 标准溶液配制

β-乳球蛋白特征多肽标准储备溶液(1 mmol/L)：称取β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK固体适量，用50 mmol/L NH₄HCO₃溶液溶解。梯度稀释配制成浓度为1、5、10、20、50、80、100 μmol/L的系列标准对照溶液。

精密称取内标物IDAL*NENK适量，用水配制成2 mmol/L储备溶液在-80 ℃冻存。临用前配制成0.1 mmol/L，4 ℃保存备用。

1.3 样品溶液的制备

精密量取牛奶1 mL，用50 mmol/L NH₄HCO₃稀释至100 mL。取200 μL的样品(稀释后的乳制品、系列标准对照溶液)，加入0.1 mmol/L内标物溶液20 μL混匀。随后加入50 mmol/L二硫苏糖醇溶液200 μL，在热鼓风恒温仪中于70 ℃反应60 min，取出后冷却至室温，加入100 mmo/L碘乙酰胺溶液200 μL，置于暗处在30 ℃反应30 min。再加入1 g/L胰蛋白酶溶液200 μL，在37 ℃反应20 h，最后加入10%(体积分数，下同)甲酸溶液200 μL，室温静置60 min终止反应。离心取上清液冻干，加入0.1%甲酸溶液200 μL复溶，过0.22 μm滤膜后，移至液相瓶中待测。

1.4 内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)的制备

采用固相合成法(见图 1)制备内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)，然后对其进行纯化，计算并分析该内标物的同位素丰度、化学纯度。

图 1

特征多肽的固相合成路线

1.5 色谱条件和质谱条件

色谱柱：Shimadzu C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相A：0.1%甲酸溶液。流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。流量：1.0 mL/min。柱温：35 ℃。进样量：10 μL。梯度洗脱：初始B相为10%，保持3 min；在8.0 min内线性升至30%；然后0.5 min内B相线性升至90%，保持2.0 min；之后在0.5 min内，B相降至10%的初始梯度条件，平衡2.0 min后开始下一个进样程序，总洗脱时间16 min。

电喷雾正离子模式：ESI⁺。质谱扫描方式：多反应监测(MRM)扫描，特征多肽IDALNENK的质荷比(m/z)为459/803，内标物IDAL*NENK的m/z为462.5/810。毛细管电压：3.5 kV。鞘气流量：13 mL/min。离子传输管温度：275 ℃。

2 结果与讨论

2.1 特征多肽的筛查

通过蛋白质组学数据库UniProt可获得β-乳球蛋白(ID：P02754)的氨基酸序列，导入酶解模拟软件Skyline模拟β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解。由于β-乳球蛋白受热或者烘烤时易发生成环、交联或者氧化等反应，选择的特征多肽若不够稳定，将会影响定性和定量结果。随着蛋白质组学的不断发展，酶解成为该领域较为成熟的技术，酶解技术结合蛋白质组学数据库及分析软件在蛋白质组学中有着举足轻重的地位。因此，在选取特征多肽时，存在漏切位点、有NXS/T的糖基化基序、易成环、易氧化、存在修饰的多肽一般不作为特征多肽的备选，从而确保特征多肽的稳定性。经此特定条件筛选的4条多肽见表 1。

表 1

β-乳球蛋白筛选后的理论酶解多肽

序号	m/z	序列	所在蛋白的位置
1	467++	LIVTQTMK	[1, 8]
2	459++	IDALNENK	[83, 90]
3	533++	VLVLDTDYK	[91, 99]
4	623++	TPEVDDEALEK	[124, 134]

2.2 特征多肽的选择

为便于乳品定量检测并降低检测成本，确定1条稳定性强和抗干扰性能优越的多肽作为β-乳球蛋白的特征多肽，对表 1筛选出的4条多肽进行了试验探索。对同一个β-乳球蛋白标准品的酶解溶液(进完样储存于4 ℃的冰箱中)，每隔6 h进样测定，试验结果表明：LIVTQTMK、IDALNENK、VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK这4条多肽在0~24 h偏移较小(见图 2)；而在24~48 h，多肽LIVTQTMK含量明显大幅下降，相比于其他3条多肽的稳定性较差。

图 2

多肽稳定性比较

为考察4条多肽的抗干扰性能，取21份β-乳球蛋白的标准溶液分成7组，每组3份平行样，分别酶解4、6、8、12、16、20、24 h，按照1.3对样品酶解后进行检测，结果见图 3。

图 3

多肽抗干扰性比较

由图 3可知：在酶解时间超过10 h后，多肽IDALNENK的含量已趋于稳定；随着酶解时间的延长，酶的自切产物不断增多，导致VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK在质谱中的响应不断升高，表明酶的自切产物对这2条多肽有增益效果，呈现出增长趋势；而对于LIVTQTMK来说，酶的自切产物对其具有抑制作用，导致其含量呈现降低趋势。因此，多肽IDALNENK的抗干扰性能强于其他3条多肽。

结合多肽稳定性和抗干扰性的比较，选择稳定性和抗干扰性都较为优越的多肽IDALNENK作为特征肽段。

2.3 IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)同位素丰度及化学纯度分析

化学纯度和同位素丰度是衡量同位素内标的关键，一般化学纯度≥98%(质量分数)、同位素丰度≥98%是优异的同位素内标，可应用于复杂样本的定量中。

2.3.1 同位素丰度分析

将合成的IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)稀释后，进行同位素丰度6次平行测定，通过特征离子质量簇，计算得出IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)的平均同位素丰度为99.2%，相对标准偏差(RSD)为0.11%，同位素丰度指标超过98%。

2.3.2 化学纯度分析

内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)市面上并无标准品，合成过程中引入的杂质均为肽段，因此采用高效液相色谱法检测后的面积归一化来进行化学纯度的衡量。内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)的高效液相色谱图见图 4。

图 4

内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)的高效液相色谱图

由图 4可知，除了2号主峰外，还有2个小杂峰，具体占比见表 2。

表 2

IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)化学纯度检测的原始数据

项目	保留时间t/min	峰面积	峰面积占比/%	峰高
峰1	3.123	31 092	0.293	5 971
峰2	9.228	10 500 823	99.111	1 160 079
峰3	11.042	63 125	0.596	1 620
总值		10 595 040	100	1 167 670

纯化后的内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)经面积归一化所得纯度为99.11%，纯度较高。从储备液中平行取出6份样品进行化学纯度检测，平均化学纯度达到98%以上，纯度较高。

根据化学纯度和同位素丰度的检测结果可知，化学纯度和同位素丰度指标均可满足对内标物的要求。

2.4 应用

在市场上购买3种不同厂商生产的奶品，各取6份样品，按1.3的方法进行处理，然后进样分析，内标法计算结果，β-乳球蛋白的测定结果见表 3。

表 3

内标法测定3种奶品中β-乳球蛋白含量

样号	测定值/(g·L^-1)	平均值/(g·L^-1)	RSD/%
1	3.59，3.74，3.60, 3.61，3.54，3.42	3.58	2.9
2	3.45，3.65，3.40，3.62，3.65，3.35	3.52	3.8
3	3.18，3.15，2.93，2.93，3.33，3.15	3.11	5.0

通过建立的同位素稀释质谱法测定3种奶品中β-乳球蛋白的含量，测定值的RSD＜6%。不同厂家生产的乳品中β-乳球蛋白的含量差异不大。

3 结语

本文采用靶向蛋白质组学技术，结合具体试验筛选出乳品主要过敏原β-乳球蛋白的特征多肽IDALNENK，该肽段稳定性好，抗干扰性能强。对制备的内标物IDAL*NENK(¹³C₆, ¹⁵N-Leu)进行化学纯度和同位素丰度的检测，同位素丰度＞98%，化学纯度＞98%，满足同位素稀释质谱法准确定量的要求。将该内标物应用于奶品中β-乳球蛋白的测定，灵敏度高，结果准确。

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