基于酶催化反应测定<sup>15</sup>N标记尿素同位素丰度 - 202204

基于酶催化反应测定¹⁵N标记尿素同位素丰度

Determination of Isotopic Abundance of <sup>15</sup>N-Labeled Uurea Based on Enzymatic Reaction

赵诚 Cheng ZHAO , 解龙 Long XIE , 徐巾岚 Jinlan XU

上海化工研究院有限公司/上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd./Shanghai Professional Technology Service Platform for Detection and Application Development of Stable Isotope, Shanghai 200062, China

摘要：

基于酶催化反应建立¹⁵N标记尿素同位素丰度的测定方法。10 mg ¹⁵N标记尿素先在50 mg脲酶溶液中催化生成¹⁵N标记碳酸铵，然后在碱性、65 ℃下分解产生¹⁵N标记氨气并用酸吸收后生成¹⁵N标记铵盐，¹⁵N标记铵盐与次溴酸钠反应生成¹⁵N标记氮气，再将生成的¹⁵N标记气体引入MAT-271型气体同位素质谱仪中检测相对原子质量为28、29和30的离子流强度，根据不同丰度范围计算¹⁵N同位素丰度。结果表明：针对低、中、高不同¹⁵N同位素丰度的尿素样品，采用脲酶催化法测定的¹⁵N丰度与微量高温燃烧法的偏差均小于0.2%，相对标准偏差均小于0.3%，适用的¹⁵N同位素丰度范围为0.365%~99.2%。脲酶催化法准确度较高，精密度良好，适用于¹⁵N标记尿素同位素丰度的检测。

关键词：

酶催化反应; 脲酶催化法; ¹⁵N标记尿素; ¹⁵N同位素丰度;

Abstract：

A method for the determination of ¹⁵N-labeled urea isotope abundance is established based on enzyme catalyzed reaction. 10 mg of ¹⁵N-labeled urea catalyzes the formation of ¹⁵N-labeled ammonium carbonate in 50 mg of urease aqueous solution, and then decomposes at alkaline and 65 ℃ to produce ¹⁵N-labeled ammonia, which is absorbed by acid to produce ¹⁵N-labeled ammonium salt. ¹⁵N-labeled ammonium salt reacts with sodium hypobromate to produce ¹⁵N-labeled nitrogen, and then the generated ¹⁵N-labeled gas is introduced into MAT-271 gas isotope mass spectrometer to detect the ion flow intensity with relative atomic masses of 28, 29 and 30, ¹⁵N isotope abundances are calculated according to different abundance ranges. The results show that for urea samples with low, medium and high ¹⁵N isotope abundances, the deviation between the ¹⁵N abundance determined by urease catalysis method and micro high temperature combustion method is less than 0.2%, the relative standard deviation is less than 0.3%, and the applicable ¹⁵N isotope abundance range is 0.365%-99.2%. Urease catalytic method has high accuracy and good precision, and is suitable for the detection of ¹⁵N-labeled urea isotope abundance.

Keyword：

enzyme catalyzed reaction; urease catalysis method; ¹⁵N-labeled urea; ¹⁵N isotope abundance;

氮元素是植物生长发育所必需的营养元素之一，是构成植物蛋白质的重要成分，在多个方面直接或间接影响植物的代谢活动和生长发育^[1-2]。随着近年来农业氮迁移转化过程等研究领域的发展，¹⁵N标记示踪技术在生态系统氮循环研究中发挥了重要作用。¹⁵N标记示踪技术是将一定数量的¹⁵N标记示踪剂(如¹⁵N标记尿素)添加到生态系统(植物、土壤或整个生态系统)中，经过一段时间后分析其去向^[3-5]。在生态系统氮循环研究方面，¹⁵N标记示踪技术不受稳定同位素分馏效应的影响，具有¹⁵N自然丰度法和传统示踪法所不具备的优点。¹⁵N标记尿素作为¹⁵N标记示踪剂在农业科学中的应用研究十分广泛，已应用于陆地生态环境系统尺度上的各个方面，如分析氮的来源、分配^[6]、利用率和去向^[7-8]、转化以及损失等^[9-11]，从而能够加深对生态系统尺度上氮循环的认识和提升氮管理的能力。在这些前沿基础科学研究的过程中，¹⁵N肥料利用率、¹⁵N损失率、¹⁵N残留率和¹⁵N氮肥分配率等，均与¹⁵N标记示踪剂的同位素丰度直接相关，因此，¹⁵N标记尿素同位素丰度的准确测定显得尤为重要。

现有的¹⁵N标记尿素同位素丰度检测方法主要有气相色谱－燃烧－同位素比值质谱法^[12]、中红外光谱法^[13]、气体同位素质谱法^[14-15]等。¹⁵N同位素丰度范围0.365%~99%的¹⁵N标记尿素均可以作为示踪剂，气体同位素质谱法在该范围内能够准确测定¹⁵N同位素丰度，因此，气体同位素质谱法是目前主要的检测方法。

气体同位素质谱法现有的前处理方法有消化法－次溴酸盐氧化联用法和微量高温燃烧法。消化法－次溴酸盐氧化联用法是在浓硫酸和接触剂的作用下，先将¹⁵N标记尿素消解生成¹⁵N标记铵盐，然后在碱性条件下通过凯氏定氮仪蒸馏出¹⁵N标记氨水，再用酸吸收得到¹⁵N标记铵盐，浓缩后用次溴酸钠转化为¹⁵N标记氮气，整个前处理过程耗时约5 h，样品消耗量在100 mg以上。微量高温燃烧法是将¹⁵N标记尿素样品中的氮元素高温氧化为氮氧化物，氮氧化物经过铜丝还原生成¹⁵N标记氮气，整个前处理过程耗时约6 h，样品消耗量在10 mg左右。上述2种前处理过程耗时均较长，因此开发一种快速的、测试结果准确的¹⁵N标记尿素同位素丰度检测方法显得尤为重要。

脲酶催化尿素测定含量的方法已经比较成熟^[16-18]，但用于¹⁵N标记尿素同位素丰度的测定却未见文献报道。本研究主要对脲酶催化反应时间、铵盐吸收反应时间和温度等参数进行了考察，并就酶催化法与微量高温燃烧法(相比消化法－次溴酸盐氧化联用法样品消耗量少)测定¹⁵N同位素丰度的结果、方法精密度、准确度等进行了对比，初步建立了基于酶催化反应测定¹⁵N标记尿素同位素丰度的方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

MAT-271型气体同位素质谱仪，美国Finnigan质谱公司；DF-101Z型智能集热式恒温磁力搅拌器，上海卫凯仪器设备有限公司；SX2-4-10型箱式电阻炉，上海实研电炉有限公司。

¹⁵N标记尿素，¹⁵N同位素丰度分别为5.10%、10.15%、60.18%、98.14%、99.18%，纯度均≥98.5%，上海化工研究院有限公司；脲酶，约1 U/mg，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；块状氧化钙，分析纯(AR)，上海麦克林生化科技有限公司；溴、氢氧化钠、线状氧化铜、溴甲酚绿指示剂、甲基红、乙醇均为AR，分子筛(5A)、铜丝(纯度99.9%)、尿素(AR，¹⁵N同位素天然丰度为0.365%)，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸，AR，江苏强盛化工有限公司。

1.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；法拉第杯；电子能量100 eV；离子源温度129 ℃；高压9.8 kV；质荷比28~45。

1.3 试验方法

1.3.1 微量高温燃烧法

(1) 反应原理

在真空、高温条件下，氧化铜分解释放氧气，氧气将¹⁵N标记尿素样品中的氮元素氧化为氮氧化物，氮氧化物经铜丝还原生成¹⁵N标记氮气^[14]，将¹⁵N标记氮气引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度，并根据不同丰度范围计算¹⁵N同位素丰度。

(2) 样品前处理

将块状氧化钙、分子筛分别破碎后过0.85 mm(20目)筛。将氧化钙、分子筛、线状氧化铜放在马弗炉中520 ℃干燥2~4 h，于100 ℃下干燥玻璃反应管2~4 h。5~10 mg ¹⁵N标记尿素样品、20~30 mg线状氧化铜、4根1~2 cm长的铜丝、20~30 mg氧化钙、4~8粒分子筛加入玻璃反应管[见图 1(a)]中。通过真空橡胶管将玻璃反应管的“1”连接抽真空系统，待真空度低于50 Pa时，使用丁烷喷枪将玻璃反应管的“2”熔封^[19]。熔封后的玻璃反应管放入箱式电阻炉中在520 ℃下反应4 h，反应结束后冷却至室温，玻璃反应管放入进样管[见图 1(b)]中，进样管的“3”连接气体同位素质谱仪，抽真空，待真空度达到仪器要求后，通过旋转“5”将反应管易碎处折断并释放气体，将气体引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度。

图 1

玻璃反应管和进样管示意

1.3.2 脲酶催化法

(1) 反应原理

脲酶催化法反应分为三步：第一步，酶具有非常高的专一性，¹⁵N标记尿素在脲酶溶液的存在下催化转化生成¹⁵N标记碳酸铵，即反应方程式(1)；第二步，¹⁵N标记碳酸铵在碱性、65 ℃条件下分解产生¹⁵N标记氨气，酸吸收¹⁵N标记氨气生成¹⁵N标记铵盐，即反应方程式(2)和(3)；第三步，¹⁵N标记铵盐与次溴酸钠反应生成¹⁵N标记氮气，即反应方程式(4)。通过酶催化反应得到的¹⁵N标记氮气引入气体同位素质谱仪中，检测质荷比为28和29的离子流强度，并计算¹⁵N同位素丰度。

图 1

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

图 2

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

图 3

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

图 4

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

(2) 样品前处理

脲酶催化法反应分为三步，故前处理也分为三步：第一步，取10~15 mg ¹⁵N标记尿素、50 mg脲酶加入铵盐吸收装置(见图 2)的50 mL烧杯中，加2 mL 4 mol/L硫酸溶液于10 mL烧杯中，加5 mL蒸馏水于50 mL烧杯中，2只烧杯中分别加入几滴溴甲酚绿－甲基红指示剂，用封口膜将50 mL烧杯封口，在40 ℃条件下酶催化反应10 min；第二步，打开封口膜，加2 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液于50 mL烧杯中，用封口膜将50 mL烧杯封口，在65 ℃条件下50 mL烧杯中产生的¹⁵N标记氨气被10 mL烧杯中的硫酸溶液吸收，10 min后打开封口膜；第三步，从上述10 mL烧杯中取2 mL的样本于双球反应管[见图 3(a)]“A”球泡中，向双球反应管“B”球泡中加入1 mL碱性次溴酸钠溶液^[20]，将进样旋塞阀[见图 3(b)]的“1”连接抽真空系统，进样旋塞阀的“3”连接双球反应管的“4”，打开进样旋塞阀的阀门“2”，待真空度低于50 Pa后，关闭进样旋塞阀的阀门“2”，一同取下进样旋塞阀和双球反应管，将双球反应管“B”球泡中的次溴酸钠溶液加入到“A”球泡中，反应生成¹⁵N标记氮气。将进样旋塞阀的“1”连接气体同位素质谱仪，将双球反应管放入液氮中，抽真空，待真空度达到仪器测试要求后，打开进样旋塞阀的阀门“2”，将生成的¹⁵N标记氮气引入气体同位素质谱仪中，检测质荷比为28、29和30的离子流强度，根据不同丰度范围计算¹⁵N同位素丰度。

图 2

铵盐吸收装置示意

图 3

双球反应管和进样旋塞阀示意

1.4 ¹⁵N同位素丰度计算

氮元素在自然界中有¹⁴N和¹⁵N等2种稳定同位素，同位素分布有¹⁴N¹⁴N、¹⁴N¹⁵N、¹⁵N¹⁵N等3种组合形式，¹⁴N¹⁴N质荷比为28，¹⁴N¹⁵N质荷比为29，¹⁵N¹⁵N质荷比为30。将反应生成的¹⁵N标记氮气引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度，根据不同丰度范围选择不同的计算公式^[21-22]。理论上式(1)和式(2)的计算结果是一致的，但当¹⁵N同位素丰度≤10%时，由于质荷比为30的离子流强度非常低，选择式(1)计算¹⁵N同位素丰度；当¹⁵N同位素丰度＞10%时，为避免进样过程中微量空气的漏入对质荷比为28的离子流强度的干扰，选择式(2)计算¹⁵N同位素丰度。

图 1

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

图 2

$ \mathrm{CO}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_2\right)_2+2 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \stackrel{\text { 脲酶 }}{\longrightarrow}\left({ }^{15} \mathrm{NH}_4\right)_2 \mathrm{CO}_3 $

式中：E——待测物质¹⁵N同位素丰度，%

I₂₈、I₂₉、I₃₀——质荷比分别为28、29、30的离子流强度，%。

2 结果与讨论

2.1 脲酶催化反应时间

酶催化反应具有温和性、高效性和专一性三大特点，酶的温和性是指酶催化反应需要在相对适宜的pH和温度条件下进行，pH过高或过低都会导致酶失活，高温也会导致酶失活，低温则会导致酶的活性不足。脲酶活性最佳pH为7.4，¹⁵N标记尿素与脲酶溶液的pH接近7.0，pH在适宜的范围内。脲酶在40~45 ℃反应活性较高，因此选择40 ℃作为酶催化反应温度。尽管酶的催化效率比无机催化剂更高，但反应速率不如酸碱滴定反应快，因此选择合适的反应时间是准确测定¹⁵N同位素丰度的关键。40 ℃条件下过量的脲酶在1 h内可将¹⁵N标记尿素完全分解^[17]。

在样品前处理时将氢氧化钠溶液加入50 mL烧杯后，烧杯中的溶液呈碱性，脲酶失活，脲酶催化反应终止。因此，反应时间是从向50 mL烧杯中加入蒸馏水开始，到加入氢氧化钠溶液结束。

取10 mg ¹⁵N同位素丰度为10.15%的¹⁵N标记尿素为试验样品，再取50 mg脲酶，铵盐吸收反应时间为10 min，检测质荷比为28的离子流强度，设置脲酶催化反应时间为60 min的离子流强度为100%，其余脲酶催化反应时间的相对强度见表 1。脲酶催化反应时间为2 min时生成的¹⁵N标记氮气较少，¹⁵N同位素丰度受本底影响偏低；反应40 min后，质荷比为28的离子流强度变化不明显；反应60 min时，¹⁵N标记尿素已经完全分解。试验结果进一步表明脲酶催化反应8 min后测定的¹⁵N同位素丰度与完全反应(60 min)时的测试结果一致，为了缩短前处理时间，脲酶催化反应时间选择为10 min。

表 1

不同脲酶催化反应时间下的¹⁵N同位素丰度

脲酶催化反应时间/min	相对强度/%	¹⁵N同位素丰度/%
2	9	9.96
5	47	10.08
8	62	10.17
10	79	10.14
15	88	10.16
20	93	10.15
40	98	10.18
60	100	10.16

2.2 铵盐吸收反应时间

第一步的脲酶催化反应对¹⁵N标记尿素转化为¹⁵N标记碳酸铵至关重要，第二步铵盐吸收反应是将¹⁵N标记碳酸铵分解的¹⁵N标记氨气或氨水吸收到硫酸中，用作第三步制备¹⁵N标记氮气的原料，第二步铵盐吸收反应起到了承上启下的作用，铵盐吸收反应时间对¹⁵N同位素丰度的检测至关重要。

试验时保持其他条件不变，仅改变第二步铵盐吸收反应时间，考察其对¹⁵N同位素丰度的影响。铵盐吸收反应时间是从铵盐吸收装置放入65 ℃水浴中开始，检测质荷比为28的离子流强度，设置铵盐吸收反应时间为80 min的离子流强度为100%，其余铵盐吸收反应时间的相对强度见表 2。在65 ℃水浴条件下，¹⁵N标记氨气或氨水蒸气释放缓慢，铵盐吸收反应进行60 min后，质荷比为28的离子流强度变化不明显；铵盐吸收反应进行80 min时，¹⁵N标记氨气或氨水释放完全。铵盐吸收反应发生2 min时生成的¹⁵N标记氮气较少，仅为仪器进样需求的三分之一，与铵盐吸收反应80 min时的¹⁵N同位素丰度差异不明显。试验结果进一步表明铵盐吸收反应进行8 min后生成的¹⁵N标记氮气可以满足仪器进样要求，为了缩短前处理时间，铵盐吸收反应时间选择为10 min。

表 2

不同铵盐吸收反应时间下的¹⁵N同位素丰度

铵盐吸收反应时间/min	相对强度/%	¹⁵N同位素丰度/%
2	11	10.10
5	29	10.16
8	42	10.14
10	53	10.15
20	79	10.18
40	92	10.13
60	99	10.16
80	100	10.19

2.3 铵盐吸收反应温度

除了反应时间对铵盐吸收过程有影响外，反应温度同样起到了至关重要的作用，因此考察了铵盐吸收反应温度对¹⁵N同位素丰度的影响。试验时保持其他条件不变，检测质荷比为28的离子流强度，设置铵盐吸收反应温度为75 ℃的离子流强度为100%，其余铵盐吸收反应温度的相对强度见表 3。在25 ℃时，几乎无氨气溢出，次溴酸钠反应后无气体生成；在35 ℃时，次溴酸钠反应后有少量气体生成，¹⁵N同位素丰度受本底影响偏低；在铵盐吸收反应温度达到45 ℃以上时，¹⁵N同位素丰度趋于稳定，相对强度随着铵盐吸收反应温度的升高而增大，相对强度越大，¹⁵N同位素丰度的精密度越好；但在75 ℃时，铵盐吸收装置内会产生雾气，同时水浴锅蒸发较快，因此铵盐吸收反应温度选择为65 ℃。

表 3

不同铵盐吸收反应温度下的¹⁵N同位素丰度

铵盐吸收反应温度/℃	相对强度/%	¹⁵N同位素丰度/%
25	0
35	8	9.73
45	16	10.18
55	54	10.18
65	80	10.17
75	100	10.16

2.4 方法精密度

按脲酶催化法的前处理方式，对低丰度(10.15%)、中丰度(60.18%)和高丰度(98.14%)3组¹⁵N标记尿素进行¹⁵N同位素丰度测定，分别平行测定6次，结果见表 4。3组不同丰度的¹⁵N标记尿素的相对标准偏差(RSD)均小于0.3%，且随着¹⁵N同位素丰度的增大，RSD逐渐减小，表明本方法在整个同位素丰度范围内精密度良好。

表 4

精密度试验结果

丰度	测定值/%						平均值/%	RSD/%
丰度	1	2	3	4	5	6	平均值/%	RSD/%
低丰度	10.17	10.19	10.12	10.14	10.16	10.14	10.15	0.25
中丰度	60.23	60.15	60.18	60.14	60.15	60.15	60.17	0.06
高丰度	98.16	98.15	98.12	98.18	98.11	98.15	98.15	0.03

2.5 不同检测方法测定结果对比

采用微量高温燃烧法和脲酶催化法两种样品前处理方式，对6组不同丰度的¹⁵N标记尿素进行同位素丰度测定(各平行测定3次)，结果见表 5。两种检测方法在¹⁵N同位素丰度为0.365%~99.18%内的偏差均小于0.2%，表明建立的检测方法准确度较高。

表 5

微量高温燃烧法与酶催化法测定结果对比

¹⁵N同位素丰度/%	测定值/%		偏差/%
¹⁵N同位素丰度/%	微量高温燃烧法	脲酶催化法	偏差/%
0.365(天然丰度)	0.365	0.365	0
5.10	5.11	5.16	0.05
10.15	10.15	10.15	0
60.18	60.21	60.08	-0.13
98.14	98.18	98.13	-0.05
99.18	99.18	99.20	0.02

微量高温燃烧法不具有专一性，对含氮有机试剂同样适用；酶催化法利用脲酶的专一性，只分解¹⁵N标记尿素，整个反应无杂质气体生成。此外，酶催化法耗时0.5 h，微量高温燃烧法至少耗时6 h。因此，酶催化法相对微量高温燃烧法具有很大的优势。

3 结语

通过对脲酶催化反应时间、铵盐吸收反应时间和温度等参数进行考察，确定最优条件下脲酶催化反应时间为10 min，铵盐吸收反应时间和温度分别为10 min和65 ℃，开发了基于酶催化反应测定¹⁵N标记尿素同位素丰度的方法。采用微量高温燃烧法和脲酶催化法测定不同¹⁵N同位素丰度的尿素样品，两种方法在¹⁵N同位素丰度为0.365%~99.18%内的偏差均小于0.2%，表明建立的检测方法准确度较高。低、中、高3组不同¹⁵N标记尿素的RSD均小于0.3%，表明方法在整个同位素丰度范围内精密度良好。建立的检测方法适用于¹⁵N标记尿素试剂同位素丰度的测定。

ckwx 参考文献

尹浩冰, 马红媛, 梁正伟. ¹⁵N稳定同位素标记技术在草地生态系统氮循环中的研究进展[J]. 土壤与作物, 2014(1): 15-21.

ELSER J J, BRACKEN M E S, CLELAND E E, et al. Global analysis of nitrogen and phosphorus limitation of primary producers in freshwater, marine and terrestrial ecosystems[J]. Ecology Letters, 2007, 10(12): 1135-1142.

KRAIMER R A, LINDEMANN W C, HERRERA E A. Distribution of ¹⁵N-labeled fertilizer applied to pecan: a case study[J]. HortScience, 2001, 36(2): 308-312.

SAN-MARTINO L, SOZZI G O, SAN-MARTINO S, et al. Isotopically-labelled nitrogen uptake and partitioning in sweet cherry as influenced by timing of fertilizer application[J]. Scientia Horticulturae, 2010, 126(1): 42-49.

ŠTURM M, KACJAN-MARŠI N, ZUPANC V, et al. Effect of different fertilisation and irrigation practices on yield, nitrogen uptake and fertiliser use efficiency of white cabbage (Brassica oleracea var. capitata L. )[J]. Scientia Horticulturae, 2010, 125(2): 103-109.

王前登, 陈波浪, 玉素甫江·玉素音, 等. 库尔勒香梨春季施用¹⁵N-尿素的吸收、分配和利用特性[J]. 应用生态学报, 2018, 29(5): 1443-1449.

李鹏飞, 李小坤, 侯文峰, 等. 应用¹⁵N示踪技术研究控释尿素在稻田中的去向及利用率[J]. 中国农业科学, 2018, 51(20): 3961-3971.

陈丽楠, 韩晓日, 孙占祥, 等. 局部根区交替灌溉与氮素耦合对葡萄生长及¹⁵N-尿素利用的影响[J]. 核农学报, 2021, 35(2): 447-453.

李鹏程, 郑苍松, 孙淼, 等. 不同形态氮肥对棉花¹⁵N回收率和产量的影响[J]. 中国土壤与肥料, 2021(5): 53-57.

梁振旭, 孙明德, 武阳, 等. 梨幼树到结果初期春施¹⁵N-尿素的利用及其在土壤的残留与损失[J]. 园艺学报, 2021, 48(1): 137-145.

丁宁, 陈倩, 许海港, 等. 施肥深度对矮化苹果¹⁵N-尿素吸收、利用及损失的影响[J]. 应用生态学报, 2015, 26(3): 755-760.

李国辉, 钟其顶, 王道兵, 等. 气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法测定发酵液中尿素δ¹³C和δ¹⁵N[J]. 质谱学报, 2016, 37(1): 60-70.

李晓丽, 何勇, 聂鹏程. 基于光谱技术的尿素¹⁵N同位素丰度快速测量法[C]//. 中国农业工程学会. 中国农业工程学会2011年学术年会论文集. 北京: 中国农业工程学会, 2011: 1272-1277.

杜晓宁, 宋明鸣, 赵诚. 质谱检测用同位素¹⁵N标记样品的处理方法[J]. 原子能科学技术, 2009, 43(增刊): 59-63.

徐晓荣, 李恒辉, 陈良. 制备土壤及植物¹⁵N样品的前处理[J]. 核农学通报, 1997, 21(3): 48-50.

周建弟, 丁关海, 郑志强. 酸性脲酶分解黄酒中尿素特性的研究[J]. 中国酿造, 2006(11): 45-46.

崔俭杰, 李琼, 林燕. 化妆品中尿素含量的测定——利用pH值差异的酶催化方法[J]. 香料香精化妆品, 2010(1): 27-30.

熊展博, 赵圣国, 王加启. 细菌脲酶分解尿素机制及其调控[J]. 中国乳业, 2021(9): 2-7.

解龙, 宋明鸣, 雷雯. 高分辨气体同位素质谱法测定重水的氘同位素丰度[J]. 化学试剂, 2021, 43(11): 1541-1545.

全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会. 稳定性同位素¹⁵N无机标记化合物: GB/T 20622—2006[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.

杨帆, 孙晓丽, 王曦, 等. 质谱准确测定高丰度¹⁵N₂的计算方法[J]. 质谱学报, 2017, 38(6): 664-670.

FIEDLER R, PROKSCH G. The determination of nitrogen-15 by emission and mass spectrometry in biochemical analysis: a review[J]. Analytica Chimica Acta, 1975, 78(1): 1-62.