复合肥料中多肽含量的测定方法研究

Study on Determination Method of Polypeptide Content in Compound Fertilizer

杨凤英 Fengying YANG , 朱洪霞 Hongxia ZHU , 邓江川 Jiangchuan DENG , 杨勇 Yong YANG

成都云图控股股份有限公司四川成都 610000 Chengdu Wintrue Holding Co., Ltd., Chengdu, Sichuan 610000, China

Author notes:

Correspondence to: 杨勇(1988—)，男，硕士，研发部部长，研究方向为肥料应用；595174321@qq.com

摘要：

提出了测定复合肥料中多肽含量的方法。采用氨基酸分析法中的离子交换色谱法测定复合肥料中总氨基酸及游离氨基酸的含量，总氨基酸含量与游离氨基酸含量的差值即为多肽含量。结果表明：尿基复合肥中多肽含量的测定值与理论值的相对偏差为6.8%~13.6%，且随着多肽含量的提高，相对偏差减小；硝基复合肥中多肽含量的测定值与理论值的相对偏差为6.8%~17.6%，相对偏差较大是因蛋氨酸、胱氨酸含量的测定值不稳定造成的，但对测定结果影响较小。离子交换色谱法具有较高的稳定性和可靠性，能够准确测定复合肥料中多肽的含量。

关键词：

多肽; 氨基酸; 复合肥料; 离子交换色谱法; 测定方法;

Abstract：

The method of determining polypeptide content in compound fertilizer is proposed. The ion exchange chromatography in amino acid analysis method is used to determine the total amino acid content and free amino acid content in the compound fertilizer. The difference between the total amino acid content and the free amino acid content is the polypeptide content. The results show that the relative deviation of the measured value of the polypeptide content in the urea based compound fertilizer is 6.8% to 13.6%, and the relative deviation decreases with the increase of the polypeptide content. The relative deviation of the measured value of the polypeptide content in the nitro compound fertilizer is 6.8% to 17.6%, which is caused by the unstable measurement value of the methionine and cystine content, but rather has a small impact on the measurement results. The ion exchange chromatography method has high stability and reliability, and can accurately determine the polypeptide content in the compound fertilizer.

Keyword：

polypeptide; amino acid; compound fertilizer; ion exchange chromatography; determination method;

早在20世纪多肽就被人们发现^[1]，其不仅是动物所需要的能源，而且是植物所需的精华物质^[2]。多肽具有较强的生物活性^[3]，已在作物营养领域得到广泛应用。作物应用机理研究表明：多肽信号分子在植物的生长、发育、生殖以及对外界环境的响应中具有重要的调节作用^[4]；系统素、植物磺化激动素等在植物中发现的多肽参与了植物的防御反应、细胞分裂、茎端生长点干细胞数目维持和花粉－柱头的识别过程^[5]；植物多肽(PAlb)通过打开L型钙离子通道引起细胞内钙升高^[6]等。在应用效果方面：叶面喷洒和根部灌注大豆多肽对毛麦酸模根中白黎芦醇的生成量增加有显著性影响^[7]；施用多聚半胱氨酸的杨梅、桃、李、樱桃的糖度比未施用的得到明显改善，可溶性固形物分别增加9.6%、0.4%、2.4%、12.9%^[8]；不同多肽能够增强作物抗高温胁迫^[9]、低温胁迫^[10]、盐胁迫^[11]等抗逆能力。多肽在促进作物生长、提高作物产量、改善果实品质、促进营养元素吸收、缩短作物采收期、缓解逆境胁迫、提高肥料利用率等方面均表现出重要的调控作用^[12]。

多肽在医药、保健食品、饲料等行业应用较为成熟，已发布实施的产品标准和检测标准有《大豆肽粉》(GB/T 22492—2008)、《海洋鱼低聚肽粉》(GB/T 22729—2008)、《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2019)、《饲料原料中酸溶蛋白的测定》(NY/T 3801—2020)、《含多肽尿素》(DB22/T 2658—2017)等。目前对复合肥料中多肽含量的检测研究较少，常用的多肽检测方法包括蛋白质分析法(以氮分析法为主)和氨基酸分析法[离子交换色谱法(IEC)、高效液相色谱法(HPLC)]。因肥料中可能含无机氮、氨基酸残基及另外加入的三聚氰胺、脲醛、双缩脲、尿素等物质，导致总氮含量偏高，采用蛋白质分析法容易造成测定结果偏高。HPLC法主要用于测定结构明确、成分清晰的多肽产品，如《动物源性食品中肌肽、鹅肌肽的测定高效液相色谱法》(NY/T 3946—2021)、《蜂毒干粉中蜂毒溶血肽含量的测定高效液相色谱法》(GB/T 40486—2021)等。IEC法比较适用于测定结构复杂多样、成分不尽相同的各种来源的多肽产品。阚微娜等^[13]采用氨基酸分析仪，以外标法定量分析游离氨基酸与酸水解后总氨基酸的含量，以总氨基酸与游离氨基酸的差值作为肽的含量，各氨基酸在质量分数20%~180%的范围内线性关系良好(r>0.999)，游离氨基酸回收率为97.2%~103.9%，总氨基酸回收率为93.1%~101.7%，相对标准偏差(RSD)小于2.0%(n=9)。张微等^[14]分析了马鹿茸不同相对分子质量肽段中水解及游离氨基酸的含量，马鹿茸肽段中氨基酸类的线性关系良好(r>0.999)；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%；加标回收率为96.6%~104.7%，RSD均小于2.4%。颜东方等^[15]以外标法定量分析2种蛋白酶解物氨基酸组分，对比肽质量分布结果发现，相对分子质量在180~1 000 u的寡肽占比达74.17%~88.52%。可以看出，IEC法在检测多肽含量方面的研究较多，准确性较高。

本文基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的IEC法，对复合肥料中多肽含量的测定开展了试验研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试验材料

(1) 仪器和主要试剂

日立L-8900型氨基酸分析仪，氨基酸分析仪所用试剂由日立公司提供。

1 nmol/μL氨基酸标准品，由北京谱合生物科技有限公司生产，货号为5061-3330。

其他试剂均为分析纯。

(2) 鱼蛋白肽

多肽质量分数为65%，游离氨基酸质量分数为4.13%，总氮质量分数为11.6%，由宁波吉丰生物科技发展有限公司生产。

(3) 尿基多肽复合肥料

处理1：添加1%(质量分数，下同)鱼蛋白肽；处理2：添加2%鱼蛋白肽；处理3：添加3%鱼蛋白肽。由眉山市新都化工复合肥有限公司将氮源(不含硝态氮)、磷源、钾源、中微量元素、辅料按组分进行滚筒造粒，然后烘干制得尿基多肽复合肥料(16-16-16)产品。

(4) 硝基多肽复合肥料

处理4：添加3%硝态氮、3%鱼蛋白肽；处理5：添加5%硝态氮、3%鱼蛋白肽；处理6：添加8%硝态氮、3%鱼蛋白肽。由眉山市新都化工复合肥有限公司将氮源(含硝态氮)、磷源、钾源、中微量元素、辅料按组分进行滚筒造粒，然后烘干制得硝基多肽复合肥料(16-16-16)产品。

1.2 试验方法

1.2.1 肥料样品制备

称取1 kg多肽复合肥料样品，经多次缩分后，取出约100g，迅速研磨至全部过0.25mm孔径筛，混合均匀，置于洁净、干燥的容器中。

1.2.2 总氨基酸溶液的制备

在110 ℃、6 mol/L盐酸溶液作用下，多肽会水解成氨基酸，然后经离子交换色谱分离和茚三酮柱后衍生化，用可见光检测器于波长440nm处测定脯氨酸的吸光度，于波长570nm处测定其他氨基酸的吸光度。

称取试样50~100mg(精确至0.1mg)，置于20mL安瓿瓶或水解管中，准确加入10mL盐酸水解溶液(6mol/L)，置于液氮中冷冻，用真空泵抽真空至7Pa(≤5×10^-2 mmHg)以喷灯封口或充氮气1min后旋紧管盖。将安瓿瓶或水解管置于(110±2)℃恒温干燥箱中，水解22~24h。冷却、混匀、开管、过滤，用移液管精确移取适量的滤液并置于旋转蒸发器或浓缩器中，在60℃抽真空蒸发至干，必要时加少量水，重复蒸干1~2次。加入3~5mL柠檬酸钠缓冲溶液[pH=2.2，c(Na⁺)=0.2mol/L]复溶，摇匀，过滤或离心，使氨基酸浓度处于氨基酸分析仪最佳检测范围内，供测定用。

1.2.3 游离氨基酸溶液的制备

称取试样2~10g(精确至0.1mg)，置于250mL容量瓶中。充分溶解后，加水至刻度，混匀，放置过夜后吸取上清液(或过滤后吸取滤液)2 mL于10mL离心管或试管中，准确加入2 mL磺基水杨酸溶液(50g/L)，混匀，放置1h。准确加入1 mL EDTA-Na溶液(10g/L)和1 mL盐酸溶液(0.06mol/L)，混匀，离心15min(或用0.45 μm的微孔滤膜过滤)。吸取上清液(或滤液)1 mL，蒸干。准确加入1~5mL柠檬酸钠缓冲溶液[pH=2.2，c(Na⁺)=0.2mol/L]，使游离氨基酸浓度处于氨基酸分析仪最佳检测范围内，供测定用。

1.2.4 多肽含量的计算

采用差减法计算多肽含量，即总氨基酸与游离氨基酸的差值。

2 结果与分析

2.1 鱼蛋白肽原料中多肽有效含量的确定

2.1.1 游离氨基酸和总氨基酸的数据分析

采用IEC法分析鱼蛋白肽氨基酸组成，结果分别见表 1、表 2。

表 1

鱼蛋白肽游离氨基酸含量测定结果

项目	测定值w/%		项目	测定值w/%
项目	平行样1	平行样2	项目	平行样1	平行样2
注：1)“-”表示未检出，下同
天门冬氨酸	0.2	0.3	蛋氨酸	-	0.1
苏氨酸	0.2	0.3	异亮氨酸	0.1	0.2
丝氨酸	0.2	0.2	亮氨酸	0.2	0.2
谷氨酸	0.3	0.3	酪氨酸	0.2	0.2
脯氨酸	0.1	0.2	苯丙氨酸	0.1	0.2
甘氨酸	0.4	0.5	赖氨酸	0.2	0.2
丙氨酸	0.6	0.7	组氨酸	-	-
胱氨酸	0.1	0.1	精氨酸	0.2	0.2
缬氨酸	0.3	0.3	合计	3.4	4.2

表 2

鱼蛋白肽总氨基酸含量测定结果

项目	测定值w/%		项目	测定值w/%
项目	平行样1	平行样2	项目	平行样1	平行样2
天门冬氨酸	5.16	5.23	蛋氨酸	1.57	1.62
苏氨酸	2.13	2.25	异亮氨酸	1.44	1.52
丝氨酸	3.36	3.40	亮氨酸	2.87	2.98
谷氨酸	8.67	8.79	酪氨酸	0.82	0.87
脯氨酸	5.61	5.85	苯丙氨酸	1.56	1.62
甘氨酸	11.67	12.02	赖氨酸	3.28	3.46
丙氨酸	5.91	6.15	组氨酸	0.88	0.89
胱氨酸	0.10	0.10	精氨酸	4.57	4.75
缬氨酸	2.02	2.12	合计	61.62	63.62

由表 1可见，鱼蛋白肽中游离氨基酸以丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量较高，总游离氨基酸平均质量分数为3.8%。由表 2可见，鱼蛋白肽中总氨基酸以甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量较高，总氨基酸平均质量分数为62.62%。参考现行行业标准《水溶肥料游离氨基酸含量的测定》 (NY/T 1975—2010)，当游离氨基酸质量分数＜10.0%时，平行测定结果的绝对差值≤1.0%；当游离氨基酸质量分数＞20.0%时，平行测定结果的绝对差值≤2.0%。试验所得游离氨基酸和总氨基酸平行样的测定结果均在允许差范围内，表明采用IEC法进行多肽含量分析，准确度高，数据可靠，误差小。

2.1.2 鱼蛋白肽中多肽理论值的计算

多肽是由多个氨基酸以不同组成和排列方式构成的，从二肽到复杂的线性或环形结构等不同肽类的总称。鱼蛋白肽经过酸解后，溶液中存在2种氨基酸，一种为肽类水解氨基酸，另一种为物料中带有的游离氨基酸，总氨基酸是鱼蛋白肽水解氨基酸与游离氨基酸的总和，即多肽含量为总氨基酸与游离氨基酸的差值。根据表 3的测定结果，计算出鱼蛋白肽中多肽理论值为58.82%。

表 3

鱼蛋白肽中多肽含量测定结果

项目	测定值w/%		平均值w/%
项目	平行样1	平行样2	平均值w/%
游离氨基酸	3.4	4.2	3.8
总氨基酸	61.62	63.62	62.62
多肽	58.22	59.42	58.82

2.2 尿基多肽复合肥料中多肽含量检测结果分析

2.2.1 尿基多肽复合肥料中总氨基酸和游离氨基酸的检测数据分析

由表 4可知：尿基多肽复合肥料中总氨基酸含量随鱼蛋白肽浓度的增加而增加；分析不同肥料试样中总氨基酸组分，均以甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量较高，与上述鱼蛋白肽原料中总氨基酸组分呈正相关，体现了IEC法的可靠性和稳定性；3种尿基复合肥料试样中均未检出游离氨基酸，原因是鱼蛋白肽测得总游离氨基酸的质量分数为3.8%，含量较低，且其在肥料试样中添加量少，按质量份计为1%~3%，可知肥料试样中游离氨基酸含量的理论值为0.038%~0.114%，很难达到检出限，因此未能检出，可忽略不计。

表 4

尿基多肽复合肥料中总氨基酸测定结果

项目	测定值w/%
项目	1%鱼蛋白肽 ①	2%鱼蛋白肽 ②	3%鱼蛋白肽 ③
天门冬氨酸	0.05	0.10	0.15
苏氨酸	-	0.04	0.06
丝氨酸	0.03	0.06	0.09
谷氨酸	0.08	0.16	0.23
脯氨酸	-	0.11	0.14
甘氨酸	0.12	0.25	0.36
丙氨酸	0.06	0.12	0.18
胱氨酸	0.01	0.02	0.01
缬氨酸	-	0.04	0.07
蛋氨酸	0.02	0.04	0.06
异亮氨酸	-	0.04	0.05
亮氨酸	-	0.06	0.09
酪氨酸	-	-	-
苯丙氨酸	-	0.04	0.05
赖氨酸	0.04	0.07	0.11
组氨酸	0.12	0.10	0.10
精氨酸	-	0.09	0.13
合计	0.53	1.34	1.88
游离氨基酸	-	-	-

2.2.2 尿基多肽复合肥料中多肽含量理论值与测定值的比较

按鱼蛋白肽添加量计算，①、②、③肥料试样中多肽含量理论值分别为0.59%、1.18%、1.76%。依据表 5进行相对偏差分析，理论值与测定值的相对偏差为6.8%~13.6%。通过上述氨基酸组分数据分析，属于误差范围内，因此IEC法适用于尿基多肽复合肥料中多肽含量的测定。

表 5

尿基多肽复合肥料中多肽含量测定结果

尿基多肽复合肥料	多肽w/%		相对偏差/%
尿基多肽复合肥料	测定值	理论值	相对偏差/%
注：1)相对偏差为差值(测定值与理论值)与理论值之比，计算结果取绝对值，下同
①	0.53	0.59	10.2
②	1.34	1.18	13.6
③	1.88	1.76	6.8

2.3 硝基多肽复合肥料中多肽含量检测结果分析

2.3.1 硝基多肽复合肥料中总氨基酸和游离氨基酸的检测数据分析

硝态氮在酸性条件下具有强氧化性，可能会引起氨基酸氧化或其他反应。为探究复合肥料中硝态氮对多肽测定的影响，对含硝态氮多肽复合肥料中游离氨基酸及总氨基酸含量进行检测。由表 6可知：总氨基酸含量中除蛋氨酸、胱氨酸含量存在差异外，其他氨基酸组分比重相当，较为稳定，结果均在误差范围内，表明IEC法可以用于含硝态氮样品的检测；同时，表 6中含3%、5%、8%硝态氮的多肽复合肥与不含硝态氮的多肽复合肥的多肽含量相差不大，说明硝态氮可能对多肽整体并无明显的负面影响，仅对残基为蛋氨酸、胱氨酸的多肽结构存在一定的负面影响。4种肥料试样中未检出游离氨基酸，原因是鱼蛋白肽中测得的总游离氨基酸质量分数为3.8%，含量较低，且在肥料试样中添加量少，按质量份计为3%，可知肥料试样中游离氨基酸含量的理论值为0.114%，各氨基酸很难达到检出限，可忽略不计。

表 6

硝基多肽复合肥料中总氨基酸测定结果

项目	测定值w/%
项目	无硝态氮 ③	3%硝态氮 ④	5%硝态氮 ⑤	8%硝态氮 ⑥
天门冬氨酸	0.15	0.15	0.15	0.15
苏氨酸	0.06	0.06	0.06	0.07
丝氨酸	0.09	0.10	0.08	0.08
谷氨酸	0.23	0.25	0.23	0.24
脯氨酸	0.14	0.16	0.17	0.18
甘氨酸	0.36	0.39	0.38	0.36
丙氨酸	0.18	0.21	0.20	0.19
胱氨酸	0.01	0.05	0.03	0.04
缬氨酸	0.07	0.10	0.09	0.12
蛋氨酸	0.06	0.04	0.12	0.14
异亮氨酸	0.05	0.04	0.05	0.07
亮氨酸	0.09	0.09	0.09	0.09
酪氨酸	-	-	-	-
苯丙氨酸	0.05	-	0.03	0.04
赖氨酸	0.11	0.11	0.11	0.11
组氨酸	0.10	0.08	0.08	0.09
精氨酸	0.13	0.12	0.11	0.10
合计	1.88	1.95	1.98	2.07
游离氨基酸	-	-	-	-

2.3.2 硝基多肽复合肥料中多肽含量理论值与测定值的比较

按鱼蛋白肽添加量计算，③、④、⑤、⑥肥料试样中多肽含量理论值为1.76%。根据表 7进行相对偏差分析，理论值与测定值的相对偏差为6.8%~17.6%。通过上述氨基酸组分数据分析，除蛋氨酸、胱氨酸存在少许差异，其余15组氨基酸检测结果为平行误差，数据稳定可靠。因此，硝态氮的存在对检测结果影响不大，IEC法适用于硝基多肽复合肥料中多肽含量的测定。

表 7

硝基多肽复合肥料中多肽含量测定结果

硝基多肽复合肥料	多肽w/%		相对偏差/%
硝基多肽复合肥料	测定值	理论值	相对偏差/%
③	1.88	1.76	6.8
④	1.95	1.76	10.8
⑤	1.98	1.76	12.5
⑥	2.07	1.76	17.6

3 结语

本文采用基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法结合的IEC法测定尿基复合肥料和硝基复合肥料中多肽的含量，结果显示多肽理论值与测定值的相对偏差为6.8%~17.6%，各氨基酸的测定结果均在允许差范围内，表明IEC法能够准确测定复合肥料中多肽的含量。同时，也发现硝态氮可能对残基为蛋氨酸、胱氨酸的多肽有负面影响，因此有必要研究蛋氨酸及胱氨酸比例较高的多肽在硝基复合肥料中的检测方法。此外，本法以水解氨基酸含量代表多肽含量，需考虑酸不仅能水解小分子的多肽，也能水解大分子的蛋白质(或肽段)，为完善复合肥料中多肽含量的检测，还需进一步研究大分子蛋白质(或肽段)与小分子多肽的分离，以定量分析复合肥料中的小分子多肽。

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