The Progress in the Synthesis of Stable Isotope Deuterium Labeled Terol Reagents and Its Application in Analytical Detection
特罗类试剂又称β-受体激动剂，是一类人工合成的苯乙醇胺类衍生物，其化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素，临床中主要用于治疗人和动物的哮喘类疾病[1-2]。β-受体激动剂对动物的代谢有调控作用，可以增强脂肪的分解，有效增加动物的瘦肉率和提高饲料转化率[3-4]。因此，β-受体激动剂常被一些不法畜产品生产者用作“饲料添加剂”，比如常见的“瘦肉精”添加剂。由于β-受体激动剂在动物体内有较长的残留时间和短期内的较大残留量，可致食用者出现肌肉震颤、行走不稳、心律失常、恶心、晕眩等中毒症状，尤其对孕妇、老人、体质虚弱者等特殊人群影响更加严重，因此各国在动物饲养过程中都禁止使用β-受体激动剂[5-7]。为了避免不法商人的违规使用和保障动物源性食品的质量安全，准确测定各类食品中β-受体激动剂的残留量十分重要。
1
特罗类试剂的检测现状
妥布特罗、马布特罗、班布特罗、溴布特罗、克伦特罗是几种常见的β-受体激动剂类药物。目前，上述几种特罗类化合物的测定方法[8]主要有气相色谱－串联质谱(GC-MS/MS)法、液相色谱－串联质谱(LC-MS/MS)法、酶联免疫吸附测定(ELIAS)法、毛细管电泳(CE)法、超临界流体色谱法、电化学分析法、分光光度法等。针对动物食品源中β-受体激动剂的检测，ELISA法是一种基于抗原抗体特异性结合和酶化学反应的测定方法，可以快速灵敏地进行检测[9]，但会出现“假阳性”结果，给实际检测带来不便。而色谱－质谱联用技术具有高分离能力、高灵敏度、高选择性、应用范围广等优点，在实际样品的分析中应用广泛。曹芳等[10]采用LC-MS/MS法测定了兔血浆、大鼠血浆中妥布特罗的含量，张立杰等[11]采用气相色谱-质谱(GC-MS)法测定了人血浆中班布特罗的含量，刘琪等[12]采用GC-MS法测定了动物组织中克伦特罗的残留量。
虽然色谱－质谱联用技术具有高选择性、高灵敏度，但是在实际样品检测中往往易受到较强的基质干扰而影响定量的准确性，同时对前处理要求较高。使用同位素内标试剂的同位素稀释质谱(IDMS)法是国际上食品安全检测最权威的仲裁检测方法[13-14]，其原理为采用与待测物具有相同分子结构的稳定性同位素(13C、15N、D等)标记的内标试剂作为内标，混合后样品中内标与待测物的离子的物质的量之比为定值，再通过质谱检测，可以有效消除基质效应和前处理损失等因素对分析结果的影响，是一种精准度高的分析方法。采用IDMS法检测动物源性食品中特罗类药物的残留，关键是要以相对应的稳定性同位素标记试剂作为内标，所以稳定性同位素氘标记特罗类试剂的合成研究十分重要。
2
稳定性同位素氘标记特罗类试剂的合成
稳定性同位素标记试剂属于高技术含量、高附加值的科研用试剂。国外在同位素标记试剂方面已形成较为完整的技术和产品链，但出于技术保密和产品垄断等原因，不仅关于合成的技术文献和专利鲜有报道，而且相关的技术标准和检测方法也未见公开[15-17]。上海化工研究院有限公司已完成了15N、18O、20Ne、22Ne、13C等稳定性同位素分离技术的研究，并逐步将稳定性同位素标记试剂的制备和检测技术进行国产化开发，以打破国外垄断。
稳定性同位素氘标记特罗类试剂的合成报道较少，已公开的合成方法：解龙等[18]以叔丁胺-D9为稳定性同位素标记前体，制备溴布特罗-D9；以4-氨基苯乙酮为起始原料，经NBS溴化、CuBr2溴化后，再与叔丁胺-D9进行胺化反应，最后使用硼氢化钠还原得到目标化合物；采用均匀设计法对反应参数进行优化，得到目标产物的化学纯度(质量分数，下同)＞98.0%，其同位素丰度＞97.0%。钟佳琪等[19]以3′, 5′-二(二甲氨基甲酰氧基)-α-溴苯乙酮为初始原料，经还原反应后与叔丁胺-D9在微波辅助下进行胺化反应，最后合成了班布特罗-D9盐酸盐；经试验验证，采用微波辅助的胺化反应速率显著提高，同时提高了叔丁胺-D9的利用率，班布特罗-D9盐酸盐的收率为89.3%，目标产物的化学纯度＞99.0%，同位素丰度＞98.5%。黄路敏等[20]以自制的叔丁胺-D9为同位素标记前体，以邻氯苯乙酮为起始原料，溴化后再与叔丁胺-D9反应得到稳定性同位素标记妥布特罗-D9；目标产物的化学纯度＞98.0%，同位素丰度＞97.5%。卢浩[21]在合成马布特罗-D9时，采用3-氯-4-氨基-5-三氟甲基苯乙酮为起始原料，叔丁胺-D9为同位素前体，经过溴化、胺化和还原等三步反应合成了同位素标记的马布特罗-D9，化学纯度为98.2%，同位素丰度＞98.0%。以上合成的氘标记特罗类试剂均能满足同位素内标试剂的纯度及丰度要求，可作为食品安全领域检测用同位素内标试剂。
随着对动物源性食品中兽药和药物添加剂检测力度的加大，国产同位素内标试剂在兽药残留检测中的作用越来越大，对保护生态环境和人体健康有着极其重要的现实意义。
3
稳定性同位素氘标记特罗类试剂在分析检测中的应用
特罗类试剂的检测需求，大多以动物源性食品中非法添加剂的残留量为出发点。兽药和非法添加剂的残留是影响动物源性食品安全的主要因素，检测过程中存在着待测物质浓度低、样品基质复杂、干扰物质多、兽药残留代谢产物多样或不明确等特点。而同位素稀释质谱法是消除待测物检测过程中基质效应、离子源的变化和信号漂移的最有效的方法之一，同时具有高精度、高准确度等优点，已广泛应用于食品安全方面的检测中[22]。利用稳定性同位素氘标记特罗类试剂可有效避免由样品处理与检测过程带来的干扰，真正做到对食品中β-受体激动剂残留量的准确定量分析。
吴平谷等[23]采用IDMS法结合固相萃取技术建立了动物组织中马布特罗、特布他林、克伦特罗等10种β2-兴奋剂残留的GC-MS检测方法。动物组织样品中添加克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D5同位素内标试剂，经无水乙醇提取、正己烷脱脂、SLS离子交换固相萃取柱净化后，用双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%(质量分数)三甲基氯硅烷衍生后，再采用GC-MS法测定。结果表明：动物组织中β2-兴奋剂的加标回收率为72.8%~110.3%，相对标准偏差(RSD)为1.2%~11.3%，检出限为0.5~1.0 μg/kg；该检测方法可以满足动物组织中兽药残留分析的要求。
岳韩笑等[24]采用IDMS结合固相萃取技术，建立了测定猪肉中克伦特罗、妥布特罗、溴布特罗和沙丁胺醇等4种β-受体激动剂残留量的GC-MS/MS法。在样品中加入同位素内标试剂克伦特罗-D9、妥布特罗-D9、溴布特罗-D9，经酶解、提取、净化、衍生后，采用GC-MS/MS法检测。结果表明：猪肉中添加2.5~35.0 μg/kg的β-受体激动剂，回收率为92.2%~112.8%，在线性范围1.35~158.0 μg/L内，相关系数r不小于0.999 8，方法检出限为0.13~0.40 μg/kg，定量限为0.40~1.27 μg/kg；该方法的精密度好、灵敏度高，可简便、准确地测定猪肉中4种β-受体激动剂的残留量。
Chen等[25]利用IDMS法，建立了同位素稀释－超高效液相色谱－串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定牛乳中克伦特罗、氯霉素和己烯雌酚的方法。样品通过HLB固相萃取小柱提取净化后，采用C18色谱柱进行UPLC-MS/MS测定。使用克伦特罗-D9、氯霉素-D5和己烯雌酚-D8作为内标物对样品进行定量分析，同时采用欧盟2002/657/EC法规进行了验证，确定了方法的特异性、检出限、定量限、精密度和稳定性。该方法适用于牛乳中克伦特罗、氯霉素和己烯雌酚的测定。
张林田等[26]采用固相萃取-UPLC-MS/MS法测定了动物源性食品中9种β2-受体激动剂的残留量。样品经水解提取后，加入克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6内标溶液，通过PCX固相萃取柱净化，采用C18色谱柱和电喷雾离子(ESI)检测器进行测定。结果表明：9种化合物的线性范围均在10.0 μg/L以内，定量限均为0.5 μg/kg；在高、中、低3个浓度水平的加标回收率为70.2%~120.0%，RSD(n=6)为3.8%~19.0%。
郭德华[27]采用高效液相色谱－串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定了11种β2-受体激动剂(包含克伦特罗、溴布特罗、马布特罗等)在猪肉及肝脏中的残留量，以克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3为同位素内标试剂，建立了一套灵敏、准确的检测方法。结果表明，目标化合物的回收率为89.4%~110.5%，RSD为1.1%~2.8%，方法检出限为0.5 ng/g。
鲁立良等[28]建立了HPLC-MS/MS法测定动物源性食品中4种β2-受体激动剂药物残留量的方法，使用克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D6等3种同位素内标试剂，基质匹配标准溶液内标法定量。结果表明：4种β2-受体激动剂质量浓度在1.0~100 g/L呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0.995 0，检出限均为0.1 μg/kg，定量限为0.25 μg/kg；在高、中、低3个浓度添加水平的回收率为81%~108%，RSD为1.3%~9.4%。该方法灵敏度高、定量准确，可用于各种动物源性食品中4种β2-受体激动剂残留量的快速测定。
姜晓野等[29]采用LC-MS/MS法测定动物源性食品中沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺的残留量，在样品前处理阶段加入沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6同位素内标试剂，经酶解、提取、净化后上机检测。结果表明：3种β-受体激动剂的质量浓度在2~100 ng/mL呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0.998，方法的检出限均小于0.1 μg/kg，加标回收率为71.4%~91.6%。该方法相对容易操作，重现性较好。
金玉娥等[30]采用LC-MS法同时测定了11种β2-受体激动剂在猪肉和肝脏中的残留量，添加沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9内标试剂进行定量分析，目标化合物的回收率为89.4%~110.5%，RSD小于2.8%，方法的检出限为0.25 μg/kg。
刘思洁等[31]采用UPLC-MS/MS法测定了动物源性食品中24种β2-受体激动剂，该方法在前处理中采用固相萃取柱作为净化手段，添加沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D9同位素内标试剂作为准确定量依据，选择离子监测模式进行检测。结果表明：各组分的定量限小于0.5 μg/kg，质量浓度在0.1~20.0 μg/kg呈线性关系，加标回收率为72.5%~109.3%。
黎娟等[32]建立了同时测定动物源性食品中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺和特布他林等4种β2-受体激动剂残留量的HPLC-MS/MS法。通过改进前处理方法，提高了提取富集效率。4种目标物均使用氘标记同位素内标试剂，空白基质加标回收率为90.3%~120.5%，RSD为1.60%~9.33%。
刘新辉等[33]通过改进前处理方法，建立了LC-MS法同时测定动物源性食品中兽药多残留的方法，可以同时检测包含克伦特罗在内的69种兽药残留量，以包含克伦特罗-D9在内的12种同位素作为内标试剂，待测物的质量浓度在0.1~50 ng/mL线性关系良好, 相关系数r大于0.99，加标回收率为84.2%~113%。
石金娥等[34]采用克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3同位素内标试剂，建立了PRIME HLB Plus Short柱结合LC-MS/MS法对猪肉、羊肉、牛肉中瘦肉精含量进行检测的方法。该方法前处理时间短，目标物的线性关系良好，检出限为0.01~0.1 μg/kg，方法的定量限为0.03~0.3 μg/kg。该方法的检出限低于国家标准《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》(GB/T 22286—2008)的检出限，可以满足畜牧肉类产品中β-受体激动剂残留量的快速检测要求。
张鑫等[35]采用克伦特罗-D9同位素内标试剂，建立了QuEChERS技术结合UPLC-MS/MS法快速测定动物源性食品中克伦特罗残留量的方法，可以在15 min内完成目标物的分离分析。克伦特罗在0.5、1.0、5.0 μg/kg添加水平的回收率为90.0%~94.3%，RSD(n=6)小于10%, 方法的检出限为0.5 μg/kg。
刘建利等[36]采用UPLC-MS/MS法测定牛血液中马布特罗、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β-受体激动剂的残留量，使用克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D6同位素内标试剂进行定量分析。结果表明：样品的加标回收率为95.4%~101.9%，RSD为0.84%~8.56%，方法满足β-受体激动剂类残留量的检测要求。
王莉莉等[37]建立了通过式固相萃取柱结合QuEChERS前处理技术-LC-MS/MS法快速测定熟肉制品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等4种常见β2-受体激动剂类兽药残留的分析方法。在样品前处理阶段添加克伦特罗-D9等同位素内标试剂，4种目标化合物的检出限为0.2~0.6 μg/kg，定量限为0.6~2.0 μg/kg。采用该方法对市售的30件熟肉样品进行目标化合物的检测，测定效果较好。
师敬敬等[38]建立了同时测定猪肉中克伦特罗、氯霉素和氯丙嗪的UPLC-MS/MS法，采用克伦特罗-D9、氯霉素-D5、氯丙嗪-D6同位素内标试剂，以同位素稀释内标法进行定量。结果表明：3种物质的质量浓度在0.2~20 μg/L呈良好的线性关系，相关系数r大于0.997，RSD小于10%，检出限为0.1 μg/kg。
蔡志斌等[39]采用UPLC-MS/MS法建立了动物源性食品中4种β2-受体激动剂的检测方法。通过在样品中加入克伦特罗-D9、特布他林-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D6等4种同位素内标试剂，同时改进前处理方法，实现了对中毒检材的快速定性确证，有助于临床医生的鉴别诊断和对中毒病人的及时临床救治。
4
展望
β-受体激动剂具有促进蛋白质合成和加速脂肪分解的生理作用，常被一些不法分子用作“饲料添加剂”，以达到促进饲养动物生长的目的。长时间、大剂量使用β-受体激动剂，容易造成在饲养动物体内的积累，从而威胁人体健康；同时，由于β-受体激动剂(如克伦特罗等)在动物体内代谢缓慢，且大部分随动物排泄物排出，将污染土壤，给农产品质量安全和食品安全带来危害。在食品安全领域，特别是针对特罗类试剂(β-受体激动剂)兽药残留的检测，IDMS法以其高准确性、低检出限等特点具有重要地位。随着稳定性同位素标记试剂在检测及科研中的广泛应用，越来越多的国产化稳定性同位素标记试剂进入市场，助力我国兽药残留检测领域的发展，也将对我国食品安全体系的建设起到极其重要的作用，为人体健康保驾护航。
沪公网安备 31010702007066号