气相色谱-串联质谱法准确测定海金沙中多种活性成分

Accurate Determination of Active Components in <i>Lygodium japonicum</i> (Thunb.) Sw.by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2022.06.016

雷雯 Wen LEI , 高慧敏 Huimin GAO , 徐增益 Zengyi XU

上海化工研究院有限公司/上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd./Shanghai Professional Technology Service Platform for Detection and Application Development of Stable Isotope, Shanghai 200062, China

摘要：

通过对样品提取条件和衍生化条件的优化，建立了气相色谱-串联质谱法多反应监测(MRM)模式测定中草药海金沙中活性成分松柏醇、香豆酸、阿魏酸含量的方法。结果表明：3种活性成分标准曲线的线性范围为0.5~10.0 mg/L，相关系数r＞0.99；方法的检出限为20.1~41.8 μg/L，定量限为67.2~139.4 μg/L，加标回收率为92.1%~101.7%，相对标准偏差(n=6)为4.2%~6.0%。

关键词：

气相色谱-串联质谱法; 海金沙; 活性成分; 测定;

Abstract：

By optimizing the extraction and derivation conditions of the sample, a method for the determination of the contents of the active components, such as coniferol, coumaric acid and ferulic acid, in Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. by gas chromatography-tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring (MRM) is established. The results show that the linear range of the standard curves of the three active ingredients is 0.5-10.0 mg/L, and the correlation coefficient r> 0.99. The detection limit of the method is 20.1-41.8 μg/L, limit of quantitation is 67.2-139.4 μg/L, the recovery is 92.1%-101.7%, and the relative standard deviation (n=6) is 4.2%-6.0%.

Keyword：

gas chromatography-tandem mass spectrometry; Lygodium japonicum (Thunb.) Sw.; active ingredient; determination;

海金沙是一种医学上常用的中药材，其干燥成熟的孢子是主要的入药部位。海金沙的藤也可入药，能起到清利湿热、通淋止痛的作用，对于治疗带状疱疹、银屑病等都有着较好的效果^[1-4]，在临床上也有着十分重要的应用^[5]。松柏醇、香豆酸、阿魏酸是海金沙主要的有效成分，种植地区土壤理化性状的不同、施用肥料的差异等都可能对海金沙的活性组分含量产生影响。这些活性组分都属于酚酸类物质、内酯类化合物，具有较为广泛的药理作用，在抗菌、抗肿瘤以及免疫抑制等方面显示出明显的药理价值，受到国内外的广泛关注。因此，测定海金沙中松柏醇、香豆酸、阿魏酸等3种活性成分含量的意义重大。

松柏醇、香豆酸、阿魏酸等活性成分的测定尚无权威的定量方法，一般化合物的定量常采用液相色谱－串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱－串联质谱法(GC-MS/MS)^[6-9]。本文优化了海金沙中活性成分的提取方式及衍生化条件，利用GC-MS/MS建立准确测定松柏醇、香豆酸、阿魏酸含量的方法，采用多反应监测(MRM)模式有效降低了样品中的基质干扰，提高了检测方法的选择性、准确度和灵敏度。所建方法可为松柏醇、香豆酸、阿魏酸等活性成分的提取、准确定量提供参考。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

7890B-7000C型气相色谱－质谱联用仪，美国Agilent公司；HP-5 MS毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司；XPE105型电子天平，精度0.01 mg，瑞士梅特勒－托利多集团公司；Milli-Q型超纯水系统，美国Merck Millipore公司；EOFO-945621型涡旋混合器，美国Talboys公司；Bionoon-24LD型高通量冷冻研磨仪，上海般诺生物科技有限公司；超细匀浆机，上海安谱科学仪器有限公司。

衍生化试剂MTBSTFA+1% t-BDMCS，美国Regis Technologies公司；松柏醇、香豆酸、阿魏酸，纯度98%，CNW公司；甲醇(色谱纯)，德国Merck公司；吡啶(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

提取与净化：干制海金沙样品液氮研磨后，称取1 g(精确至0.1 mg)置于20 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋振荡3 min，低温超声2 h，振荡仪振摇2 h，于4 ℃以11 000 r/min转速离心20 min，上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后，取5 mL冷冻干燥。

衍生化：在冷冻干燥后的样品中分别加入100 μL的MTBSTFA+1% t-BDMCS和吡啶，于70 ℃反应2 h，取出放至室温后以1 000 r/min转速离心5 min，取上清液至进样瓶中待GC-MS/MS分析。

1.2.2 标准溶液的配制

用甲醇配制质量浓度为0.1 mg/mL的松柏醇、香豆酸、阿魏酸标准储备溶液，分别移取5、10、20、30、50、80、100 μL的标准储备溶液至进样瓶中，并补加甲醇至1 mL，冷冻干燥后按1.2.1的衍生化步骤进行处理。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：Agilent HP-5 MS毛细管柱；载气：高纯氦气，纯度99.999%，流量1.0 mL/min；进样口温度：280 ℃；升温程序：初始温度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；进样量：1 μL；分流体积比：1 ∶50。

质谱分析条件：电子轰击离子源(EI)，电离能量70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；接口温度：300 ℃。检测方式：MRM，溶剂延迟8 min。松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化产物的质谱采集信息见表 1，其中带*的为定量离子。

表 1

松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化产物的质谱参数

化合物	保留时间/min	母离子(m/z)	监测离子对(m/z)	碰撞能量/eV
松柏醇	23.3	351	205^*/279	15
香豆酸	23.4	335	261^*/73	18
阿魏酸	24.6	365	249^*/291	18

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

提取植物样本中有机物常用的方法有冷冻研磨法、液氮研磨法和匀浆法。试验对比了上述3种方法，对提取海金沙中松柏醇、香豆酸、阿魏酸的方法进行了优化。

(1) 冷冻研磨法

取0.5 g干制海金沙样品与研磨球一起放入离心管中，液氮冷冻10~15 min后置于样品台，研磨仪设置振动频率60 Hz，运行时间为20 min，按1.2.1方法处理后，待GC-MS/MS分析。

(2) 液氮研磨法

取干制海金沙样品放入预冷后的研钵内，倒入适量液氮，用钵杵反复研磨，待液氮挥发后，继续倒入液氮重复该过程，直至样品变成均匀的粉末。取1 g(精确至0.1 mg)已研磨的样品至20 mL离心管中，按1.2.1方法处理后，待GC-MS/MS分析。

(3) 匀浆法

取1 g(精确至0.1 mg)干制海金沙样品，放入50 mL离心管中后，加入10 mL甲醇，将匀浆机调至3档，匀浆3 min。随后将离心管涡旋振荡3 min，按1.2.1方法衍生后，待GC-MS/MS分析。

(4) 结果对比

试验以目标物峰面积为考察对象，比较不同提取方法的目标物提取率，见图 1。

图 1

不同提取方法的目标物提取率

由图 1可知，液氮研磨法提取的3种目标物量最多，冷冻研磨法和匀浆法均不如液氮研磨法。由于海金沙样品中含有大量的纤维素，采用冷冻研磨法无法将样品完全磨碎；匀浆法在提取时会产生热量，即使采用冰水浴也难以控制温度；液氮研磨法不仅能对样品充分研磨，而且在研磨过程中温度可控。因此试验选用液氮研磨法提取海金沙中的松柏醇、香豆酸、阿魏酸。

2.2 衍生化条件的优化

由于3种目标物的沸点较高，无法直接上机检测。利用衍生化试剂与目标物反应，得到的衍生化产物具有较低的沸点和较好的热稳定性。MTBSTFA是一种常用的硅烷化衍生试剂，MTBSTFA的叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)将取代目标物中含有活性氢的基团，使衍生后的产物沸点和极性降低，具有更好的热稳定性。MTBSTFA与松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化反应示意见图 2。

图 2

MTBSTFA与松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化反应示意

(1) 衍生化反应时间

取5份100 μg/L标准溶液冷冻离心干燥后，在70 ℃下分别按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h进行衍生，上机检测后记录松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化产物峰面积，结果见表 2。

表 2

衍生化反应时间对衍生效果的影响

样品批次	衍生化反应时间/h	峰面积
样品批次	衍生化反应时间/h	松柏醇	香豆酸	阿魏酸
1	0.5	5.12×10⁴	4.03×10⁴	6.26×10⁴
2	1.0	7.64×10⁵	5.22×10⁵	7.35×10⁵
3	1.5	2.15×10⁷	3.57×10⁷	1.45×10⁷
4	2.0	4.89×10⁷	9.34×10⁷	5.11×10⁷
5	2.5	4.90×10⁷	9.35×10⁷	5.14×10⁷

由表 2可知：当衍生化反应时间为0.5 h时，峰面积较小，表明未能使有效目标物全部衍生；当衍生化反应时间为2.0 h时，峰面积迅速增加近1 000倍；继续延长衍生化反应时间，峰面积增加不明显。试验结果表明，2.0 h内衍生化试剂与目标物基本反应完全，进一步延长衍生化反应时间，峰面积无明显变化，故试验选择2.0 h作为衍生化反应时间。

(2) 衍生化反应温度

取5份100 μg/L标准溶液冷冻离心干燥后，分别在40、50、60、70、80 ℃下衍生化反应2.0 h，上机检测后记录松柏醇、香豆酸、阿魏酸的衍生化产物峰面积，结果见表 3。

表 3

衍生化反应温度对衍生效果的影响

样品批次	衍生化反应温度/℃	峰面积
样品批次	衍生化反应温度/℃	松柏醇	香豆酸	阿魏酸
1	40	2.03×10³	4.04×10⁴	6.22×10⁴
2	50	8.94×10⁴	5.25×10⁵	7.35×10⁵
3	60	4.56×10⁶	3.56×10⁷	1.49×10⁷
4	70	4.89×10⁷	9.34×10⁷	5.11×10⁷
5	80	4.88×10⁷	9.34×10⁷	5.13×10⁷

从表 3可看出：当衍生化反应温度为70 ℃时，衍生效果较好；衍生化反应温度升至80 ℃时，峰面积增加不明显，故试验选择70 ℃作为衍生化反应温度。

2.3 检测方法的开发

选用100 μg/L松柏醇、香豆酸、阿魏酸标准溶液，按2.2优化的衍生化条件，通过产物离子扫描(Product)模式优化碰撞能量，建立测定松柏醇、香豆酸、阿魏酸含量的方法。以MRM模式检测实际样品中的目标物(见图 3)，可降低样品中基质的干扰，提高检测的选择性、准确度和灵敏度，比全扫描(Scan)模式具有更强的降噪功能。

图 3

不同工作模式下检测的总离子流

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、定量限和检出限

将1.2.2配制的系列标准溶液冷冻干燥衍生化后，采用优化的MRM模式进样测定，以待测物质量浓度为横坐标，峰强度为纵坐标，绘制标准曲线，分别以3倍、10倍信噪比计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。松柏醇、香豆酸、阿魏酸的质量浓度在0.5~10.0 mg/L范围内标准曲线呈线性，相关系数r均大于0.99。方法的检出限和定量限均为20.1~41.8 μg/L和67.2~139.4 μg/L。

2.4.2 精密度和加标回收率

取2份同一批次处理的样品，液氮研磨后，其中一份加入混合标准溶液200 μL，另一份加入超纯水200 μL，按试验方法分别上机连续测定6次，记录定量离子峰面积，计算加标回收率和精密度，结果见表 4。

表 4

加标回收率和相对标准偏差(n=6)

目标物	平均加标回收率/%	RSD/%
松柏醇	97.9	4.2
香豆酸	101.7	5.3
阿魏酸	92.1	6.0

由表 4可知，松柏醇、香豆酸、阿魏酸的平均加标回收率为92.1%~101.7%，测定结果的精密度为4.2%~6.0%。

2.5 实际样品的测定

采用上述优化的提取与衍生化方法，利用GC-MS/MS对海金沙中的活性物质松柏醇、香豆酸、阿魏酸含量进行测定，结果见图 4。

图 4

实际样品在MRM模式下的离子流

3 结语

通过优化提取条件、衍生化反应条件等，采用MRM模式，建立了准确测定海金沙中松柏醇、香豆酸、阿魏酸等3种活性组分含量的方法。结果表明，该检测方法重现性好、回收率和精密度高，松柏醇、香豆酸、阿魏酸的检出限和定量限均为20.1~41.8 μg/L和67.2~139.4 μg/L，平均加标回收率为92.1%~101.7%，测定结果的精密度为4.2%~6.0%，可为松柏醇、香豆酸、阿魏酸等活性成分的准确定量提供方法参考。

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