气相色谱法测定稳定同位素<sup>13</sup>C标记辛酸纯度的不确定度评定 - 202301

气相色谱法测定稳定同位素¹³C标记辛酸纯度的不确定度评定

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Purity of Stable Isotope <sup>13</sup>C Labelled Octanoic Acid by Gas Chromatography

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2023.01.013

赵诚 Cheng ZHAO , 孙雯 Wen SUN , 袁璋晶 Zhangjing YUAN

上海化工研究院有限公司/上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台上海 200062 Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd./Shanghai Professional Technology Service Platform for Detection and Application Development of Stable Isotope, Shanghai 200062, China

摘要：

根据行业标准《稳定同位素¹³C标记的辛酸》(HG/T 5941—2021)，采用气相色谱法测定稳定同位素¹³C标记的辛酸纯度，对测定过程中的不确定度来源进行了分析，主要为标准溶液配制、标准曲线拟合、样品制备和样品测量重复性等。按《测定不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)的规定进行不确定度计算，稳定同位素¹³C标记的辛酸纯度的测量不确定度来源主要为标准溶液配制与标准曲线拟合，其合成标准不确定度为0.817%，扩展不确定度为1.6%，测定结果为99.0%±1.6%(k=2)。

关键词：

稳定同位素; ¹³C标记辛酸; 气相色谱法; 不确定度;

Abstract：

According to the industry standard Stable isotope ¹³C labelled Octanoic acid (HG/T 5941—2021), the purity of octanoic acid labeled with stable isotope ¹³C is determined by gas chromatography, and the sources of uncertainty in the determination process are analyzed, mainly including standard solution preparation, standard curve fitting, sample preparation and sample measurement repeatability. The uncertainty is calculated according to the provisions of Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement (JJF 1059.1—2012). The source of uncertainty in the measurement of octanoic acid purity labelled with stable isotope ¹³C is mainly the preparation of standard solution and the fitting of standard curve. The combined standard uncertainty is 0.817%, the expanded uncertainty is 1.6%, and the measurement result is 99.0% ± 1.6% (k=2).

Keyword：

stable isotope; ¹³C labelled octanoic acid; gas chromatography; uncertainty;

¹³C稳定同位素是一种无放射性的示踪剂，广泛应用于与人类健康息息相关的各个领域中，如农业科学、生态环境、医学及临床诊断等。近年来，以¹³C稳定同位素作为示踪剂的同位素示踪技术越来越多地应用于研究全球气候变化和土壤碳动态变化中^[1]。在农业科学领域，国内外许多专家利用¹³C稳定同位素示踪技术解释了土壤中有机氮的动态变化过程，探索土壤团聚体固氮机理及研究土壤固氮潜力^[2-4]。在生态环境领域，同位素示踪技术是解释陆地生态系统碳循环的重要工具。在医学与临床诊断领域，随着对¹³C呼气试验所开展的临床诊断与研究，使¹³C标记化合物的应用领域更加广泛^[5-7]。目前，我国稳定同位素标记技术飞速发展，相应的检测技术也日趋完善与普及，越来越多的¹³C呼气试剂应用于临床试验中，其非创伤性的优点^[8]已成为核医学诊断的重要工具之一，在临床诊断中的应用前景广阔。

¹³C标记的辛酸作为呼气试剂应用于胃固体排空及消化功能的测试^[9-12]，试验中所使用的¹³C标记辛酸大多从国外进口，质量评价方法的缺乏成为限制我国高端试剂自主化生产的瓶颈。行业标准《稳定同位素¹³C标记的辛酸》(HG/T 5941—2021)^[13]于2022年4月正式实施，该标准推荐了¹³C标记辛酸化学纯度及同位素丰度的检测方法，对国产化稳定同位素标记辛酸产品的质量控制具有重要意义。本文依据测量不确定度评定规范及准则^[14-16]，通过对¹³C标记辛酸化学纯度测定过程中各不确定度的来源进行分析，建立了采用气相色谱法进行稳定同位素¹³C标记辛酸化学纯度不确定度评定的方法，以期为提升检测结果的准确性和可靠性提供参考。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：7890A型气相色谱仪，美国Agilent公司；MSA225S型电子天平，德国Sartorius公司。

主要试剂：辛酸标准品，纯度(质量分数，下同)为99.2%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；¹³C标记辛酸，纯度为99.1%，上海化工研究院有限公司；丙酮，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 测定条件

色谱柱：HP-5柱，30 m×0.25 mm，0.5 μm；进样方法：分流进样，分流比为10∶1；进样口温度：250 ℃；载气：N₂；载气流量：1.0 mL/min；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；检测器温度：250 ℃；H₂流量：30 mL/min；空气流量：400 mL/min；色谱柱温度：50 ℃保持1 min，以40 ℃/min升温至230 ℃保持5 min；进样量：1 μL。

1.3 试验步骤

1.3.1 标准储备溶液的配制

准确称取250 mg(精确到0.01 mg)辛酸标准品于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解后稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度10 mg/mL的标准储备溶液。

1.3.2 系列标准工作溶液的配制

将1.3.1配制的标准储备溶液用丙酮稀释，得到质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mg/mL的系列标准工作溶液。

1.3.3 标准工作曲线的建立

将1.3.2配制的系列标准工作溶液用微孔滤膜过滤后进行气相色谱分析，各标准工作溶液重复测定3次。以标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以3次测得的峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准工作曲线。

1.3.4 样品溶液的制备

准确称取20 mg(精确到0.01 mg)¹³C标记辛酸样品于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解后稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度为2.0 mg/mL的样品溶液。

1.3.5 样品溶液的测定

将1.3.4制备的样品溶液用微孔滤膜过滤后，依据HG/T 5941—2021，采用气相色谱法进行化学纯度测定。每份试液重复测定3次，计算3次测得的峰面积的平均值，根据标准工作曲线得到试液的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 数学模型

¹³C标记辛酸样品的纯度w用质量分数表示，按式(1)计算：

图 1

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

式中：w——¹³C标记辛酸样品纯度，%；

ρ——¹³C标记辛酸样品的峰面积平均值在标准工作曲线上对应的质量浓度，mg/mL；

V——¹³C标记辛酸样品的定容体积，mL；

w_S——辛酸标准品标注纯度，%；

k——¹³C标记辛酸与天然丰度辛酸标准品的质量校正系数，取值1.01；

m——¹³C标记辛酸样品的称样量，mg。

2.2 不确定度的来源分析

从数学模型、样品制备过程等方面分析，同时参考各类不确定度评定文献^[17-19]，确定气相色谱法测定¹³C标记辛酸样品纯度的不确定度主要来源为：①标准溶液配制及检测过程，包括标准品称样量、标准溶液制备、标准品纯度、标准曲线拟合等；②样品溶液配制及检测过程，包括样品称样量、样品溶液制备、样品重复测量等。

2.3 不确定度分量评定

2.3.1 标准溶液配制及检测过程引入的相对标准不确定度u_rel(1)

(1) 标准品称量引入的相对标准不确定度u_rel(m₁)

采用精度为0.01 mg的分析天平称取250.32 mg辛酸标准品，天平检定证书给出的最大允许误差为±0.3 mg，根据矩形分布计算，标准不确定度 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，相对标准不确定度u_rel(m₁)=0.173 2/250.32=0.000 692。

(2) 标准溶液制备过程引入的相对标准不确定度u_rel(V₁)

标准溶液制备过程引入的不确定度，主要来源于容量瓶、分度吸量管的允许误差及溶液制备过程中温度的变化。依据《常用玻璃量器检定规程》(JJG 196—2006)^[20]所提供的允许误差，按三角分布，取 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，计算容量瓶、分度吸量管引入的不确定度；进行试验时，实验室温度在(20±4) ℃范围内波动，取水体积膨胀系数为2.1×10^-4/℃，按矩形分布进行计算，见表 1。

表 1

标准溶液配制引入的不确定度

量具	允许误差/mL	使用次数/次	玻璃量具标准不确定度/mL	溶液膨胀标准不确定度/mL	各分量的相对标准不确定度
25 mL容量瓶	±0.03	1	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $
10 mL容量瓶	±0.020	5	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $
5 mL分度吸量管	±0.025	3	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $
1 mL分度吸量管	±0.008	2	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $	$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

根据表 1中各分量的相对标准不确定度，计算标准溶液制备过程引入的合成相对标准不确定度u_rel(V₁)：

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

(3) 标准品纯度引入的相对标准不确定度u_rel(w₁)

辛酸标准品证书显示其纯度为99.2%，不确定度为0.005，则标准品引入的标准不确定度为u(w₁)=0.005/2=0.002 5，相对标准不确定度u_rel(w₁)=0.002 5/0.992=0.002 520。

(4) 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度u_rel(L)

将1.3.2配制的系列标准工作溶液重复测定3次，采用最小二乘法对测得的峰面积平均值y与辛酸的质量浓度x进行拟合，线性方程及不确定度见表 2。辛酸标准溶液峰面积的剩余标准偏差S_y采用式(2)进行计算，标准曲线拟合引入的不确定度按式(3)计算。

表 2

标准曲线拟合引入的不确定度

ρ(辛酸)/(mg·mL^-1)	峰面积测定值			平均峰面积	线性方程及相关系数	S_y	u(L)	u_rel(L)
ρ(辛酸)/(mg·mL^-1)	1	2	3	平均峰面积	线性方程及相关系数	S_y	u(L)	u_rel(L)
0.5	672	676	668	672	y=1 282.4x+25.711 r=0.999 9	15.67	0.007 7	0.003 709
1.0	1 311	1 320	1 315	1 315
1.5	1 960	1 957	1 964	1 960
2.5	3 206	3 210	3 207	3 208
5.0	6 451	6 459	6 458	6 456

图 2

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

式中：y_i——辛酸系列标准工作溶液的峰面积；

ρ_i——辛酸系列标准工作溶液的质量浓度，mg/mL；

a——线性方程中的斜率；

b——线性方程中的截距；

n——辛酸系列标准工作溶液重复测定次数, 取值15。

图 3

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

式中：ρ₀——被测样品质量浓度，取值2.076，mg/mL；

ρ——辛酸系列标准工作溶液的质量浓度的平均值，mg/mL；

p——¹³C标记辛酸样品测定次数，取值3。

称取20.76 mg ¹³C标记辛酸样品于10 mL容量瓶中，得到质量浓度为2.076 mg/mL的样品溶液，标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

u_rel(L)=u(L)/ρ₀=0.007 7/2.076=0.003 709

标准溶液的配制及检测过程引入的相对标准不确定度u_rel(1)由u_rel(m₁)、u_rel(V₁)、u_rel(w₁)、u_rel(L)进行合成，即：

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

2.3.2 样品溶液配制及检测过程引入的相对标准不确定度u_rel(2)

(1) 样品称量引入的相对标准不确定度u_rel(m₂)

采用精度为0.01 mg的分析天平称取20.76 mg ¹³C标记辛酸样品，最大允许误差为±0.08 mg，根据矩形分布计算，标准不确定度 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，则相对标准不确定度u_rel(m₂)=0.046 2/20.76=0.002 225。

(2) 样品溶液制备过程引入的相对标准不确定度u_rel(V₂)

样品溶液采用10 mL容量瓶配制(使用1次)，10 mL容量瓶允许误差为±0.020 mL，按三角分布，取 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，则标准不确定度为 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ 。进行试验时，实验室温度在(20±4)℃范围内波动，取水体积膨胀系数为2.1×10^-4/℃，按矩形分布进行计算，溶液膨胀标准不确定度为 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，样品溶液制备过程中相对标准不确定度 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ 。

(3) 样品检测重复性引入的相对标准不确定度u_rel(R)

重复称取¹³C标记辛酸样品6次，在相同条件下进行检测，其化学纯度分别为98.7%、99.3%、98.8%、98.9%、98.7%、99.4%，平均纯度为99.0%，标准偏差为0.281%，则标准不确定度 $ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $ ，样品检测重复性引入的相对标准不确定度为u_rel(R)=0.001 1/0.99=0.001 111。

样品溶液配制及检测过程引入的相对标准不确定度u_rel(2) 由u_rel(m₂)、u_rel(V₂)、u_rel(R)进行合成，即：

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

2.4 合成相对标准不确定度u_rel(X)

气相色谱法测定稳定同位素¹³C标记辛酸化学纯度的合成相对标准不确定度为：

$ w = k\frac{{\rho \cdot V \cdot {w_{\rm{S}}}}}{m} \times 100 $

试验测得¹³C标记辛酸化学纯度平均值X为99.0%，则u(X)=u_rel(X)×X=0.008 254×99.0%=0.817%。

2.5 扩展不确定度U(X)和测量结果的表示

在95%的置信度下，包含因子k=2，扩展不确定度U(X)=k×u(X)=2×0.817%=1.6%。

当测得稳定同位素¹³C标记辛酸化学纯度为99.0%时，其结果可表示为99.0%±1.6%。

3 结语

本研究采用气相色谱法测定稳定同位素¹³C标记辛酸化学纯度，并对定量分析过程中可能产生的不确定度分量的来源进行分析、评定。由结果可知，辛酸标准溶液配制及标准曲线拟合所产生的不确定度较大，在实际样品的检测中，可通过提高仪器的稳定性和分析人员的操作熟练程度，减小标准曲线拟合引入的不确定度。

ckwx 参考文献

金鑫鑫, 汪景宽, 孙良杰, 等. 稳定¹³C同位素示踪技术在农田土壤碳循环和团聚体固碳研究中的应用进展[J]. 土壤, 2017, 49(2): 217-224.

田秋香, 张威, 闫颖, 等. 稳定性同位素技术在土壤重要有机组分循环转化研究中的应用[J]. 土壤, 2011, 43(6): 862-869.

LI S Y, GU X, ZHUANG J, et al. Distribution and storage of crop residue carbon in aggregates and its contribution to organic carbon of soil with low fertility[J]. Soil and Tillage Research, 2016, 155: 199-206. doi:10.1016/j.still.2015.08.009

LAL R. Carbon management in agricultural soils[J]. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 2007, 12: 303-322. doi:10.1007/s11027-006-9036-7

MAKRIDIS G, SCHNITZLER L J, REESE T, et al. The early results of the first intraoperative measurement of liver functional capacity using the ¹³C-methacetin-breath test during liver surgery[J]. HPB, 2020, 22(Supplement 2): S307.

URIBARRI-GONZALEZ L, LARI ŃO-NOIA J, NIETO-GARCIA L, et al. Pancreatic function as evaluated by the 13C-MTG breath test in patients after bariatric surgery[J]. Pancreatology, 2016, 16(3): S115.

TAKIMOTO M, TOMITA T, YAMASAKI T, et al. Effect of vonoprazan, a potassium-competitive acid blocker, on the ¹³C-urea breath test in Helicobacter pylori-Positive Patients[J]. Dig Dis Sci, 2017, 62: 739-745. doi:10.1007/s10620-016-4439-0

雷雯, 杜晓宁, 张维冰. 气相色谱－质谱法研究¹³C标记脂肪酸的同位素丰度和化学纯度[J]. 质谱学报, 2015, 36(5): 434-441.

BRUNO G, LOPETUSO L R, Ianiro G, et al. Sa1344 study of gastric emptying and digestive function with 13C octanoic acid breath test in non dyspeptic healthy volunteers[J]. Gastroenterology, 2014, 146(5): S-268.

CAVIGLIA G P, SGUAZZINI C, CISARÒ F, et al. Gastric emptying and related symptoms in patients treated with buspirone, amitriptyline or clebopride: a "real world" study by 13C-octanoic Acid Breath Test[J]. Minerva Medica, 2017, 108(6): 489-495.

王永席, 贾泽博, 翟红兵, 等. ¹³C-辛酸呼气试验测定消化性溃疡患者胃固体排空功能的临床研究[J]. 国际消化病杂志, 2016, 36(4): 242-244.

杨尚品, 卢云, 周晓彬, 等. 远端胃大部切除术后胃排空的¹³C-辛酸呼气试验测定[J]. 齐鲁医学杂志, 2016, 31(2): 135-137.

全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会. 稳定同位素¹³C标记的辛酸: HG/T 5941—2021[S]. 北京: 化学工业出版社, 2022.

全国法制计量管理计量技术委员会. 测量不确定度评定与表示: JJF 1059.1—2012[S]. 北京: 中国计量出版社, 2012.

全国物理化学计量技术委员会. 化学分析测量不确定度评定: JJF 1135—2005[S]. 北京: 中国计量出版社, 2005.

中国合格评定国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评估指南: CNAS-GL006: 2018[S]北京: 中国质检出版社, 2018.

刘卫, 段路路, 翟帅. 微波消解－电感耦合等离子体质谱法测定土壤样品中重金属含量的不确定度评定[J]. 肥料与健康, 2021, 48(1): 67-74.

孙冰洁, 宋吉利, 郝昕. 复混肥料中总氮含量测定的不确定度评定[J]. 肥料与健康, 2022, 49(2): 73-76.

黄河清, 高文君, 牛彦超. 超高效液相色谱法测定稳定性肥料中双氰胺含量的不确定度评定[J]. 肥料与健康, 2021, 48(2): 63-67.

全国流量容量计量技术委员会. 常用玻璃量器检定规程: JJG 196—2006[S]. 北京: 中国计量出版社, 2007.