计算机辅助模拟技术在脲酶抑制剂筛选中的应用

Application of Computer Aided Simulation Technology in Screening of Urease Inhibitors

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2023.02.004

谢勇飞 Yongfei XIE , 束维正 Weizheng SHU , 李慧敏 Huimin LI , 胡婷婷 Tingting HU , 陈骏 Jun CHEN

中盐安徽红四方肥业股份有限公司安徽合肥 231602 CNSG Anhui Hongsifang Co., Ltd., Hefei, Anhui 231602, China

摘要：

尿素施入土壤后发生快速水解，植物无法有效吸收施入土壤中的养分，造成氮素利用率较低。通过分子对接模拟软件，对脲酶4gy7晶体结构进行处理，经分子动力学优化，分别与尿素、正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、对苯二酚(HQ)、(2-硝基苯基)磷酸三酰胺(2-NPT)、ZINC数据库中的9 617个小分子进行分子对接，评价其相互作用关系，筛选潜在的脲酶抑制剂小分子。结果表明：尿素、NBPT、HQ、2-NPT与脲酶的平均结合能依次为30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol，NBPT的效果较理想；9 617个小分子的相互作用分析显示，其中5 883个小分子可能与脲酶存在相互作用关系，筛选到35个平均结合能大于55 kJ/mol的潜在脲酶抑制剂。计算机辅助模拟技术为新型脲酶抑制剂的开发提供了新的思路。

关键词：

脲酶抑制剂; 计算机辅助模拟; 分子对接; 应用;

Abstract：

Due to the fact that urea is rapidly hydrolyzed after being applied into the soil, plants cannot effectively absorb the nutrients applied into the soil which result in low nitrogen utilization rate. Through molecular docking simulation software, the crystal structure of urease 4gy7 is processed, the molecular dynamics is optimized, the structure is docked with urea, n-butyl phosphorothiotriamide (NBPT), hydroquinone (HQ), (2-nitrophenyl) phosphate triamide (2-NPT), and 9 617 small molecules in ZINC database, respectively, to evaluate interaction relationship and screen potential urease inhibitor small molecules. The results show that the average binding energy of urea, NBPT, HQ, 2-NPT and urease is 30.91、32.92、28.36 and 18.63 kJ/mol respectively, and the effect of NBPT is ideal. The interaction analysis of 9 617 small molecules show that 5 883 of them may have interaction with urease, and 35 potential urease inhibitors with average binding energy greater than 55 kJ/mol are screened. Computer aided simulation technology provides a new idea for the development of new urease inhibitors.

Keyword：

urease inhibitor; computer aided simulation; molecular docking; application;

0 前言

脲酶是一种能够催化尿素水解的土壤含镍酶。尿素进入土壤后，酰胺态氮并不能被作物直接吸收利用，脲酶可催化酰胺态氮水解为铵态氮，作物以铵态氮或硝态氮形式吸收转化氮营养元素^[1]。尿素过快转化为铵态氮会造成氨挥发，降低了施入土壤的氮素利用率。脲酶抑制剂可与尿素形成竞争性抑制，减少尿素的过量转化，降低尿素的水解速率，减缓铵态氮的挥发和硝化过程。

研究发现，脲酶抑制剂的作用机制包括以下4个方面：一是脲酶抑制剂竞争占居了土壤中脲酶催化活性中心位置，减少了尿素与脲酶结合的概率，降低了酶的活性；二是脲酶抑制剂多具有还原性，还原性物质可改变土壤氧化水平，减弱脲酶在土壤中的催化效果；三是部分脲酶抑制剂为脲酶生物合成抑制剂，可减弱合成脲酶的微生物的代谢，使脲酶生物合成过程受阻，减少土壤中脲酶的含量，参与反应的尿素变少，水解速率降低；四是选择与尿素结构相似的化合物，使其在随水移动的过程中与脲酶发生作用，替代尿素进行分解或结合，起到保护尿素不被分解的目的。田间施用尿素的同时追施一定量的脲酶抑制剂，可有效降低土壤中脲酶的活性，减缓尿素的分解速率，减少土壤中氨的挥发，减弱对铵的硝化作用。

脲酶抑制剂发挥作用需要土壤具备适当的条件。影响脲酶抑制剂活性的因素包括土壤的酸碱度、通透性、有机物含量、水含量等，同时需要考虑土壤中尿素含量。脲酶抑制剂的种类较多，作用的环境条件也不同。如苯基磷酰二胺(PPD)是一种被认为有潜力的脲酶抑制剂，对酸碱度比较敏感，容易分解形成酚类物质，而酚是一种比较弱的脲酶抑制剂。对苯二酚(HQ)在通气性良好的条件下使用时，效果比正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)和PPD差。NBPT受土壤酸碱度的影响相对较小，有文献报道，在碱性土壤中更适合使用NBPT^[2]。因此，各种脲酶抑制剂由于作用机制、土壤作用条件不同，使用方法也不同，但在脲酶活性高的土壤上施用脲酶抑制剂，抑制作用较好。

NBPT和HQ是两种研究较多的脲酶抑制剂。HQ通过减少尿素的水解以降低氨的挥发和硝化作用，提高了酰胺态氮的利用率，延长了铵态氮对作物的有效持续供应时间并减少了损失。邢卫等^[3]的研究发现，在土壤中施用尿素，当NBPT的用量为尿素氮的0.2%时，可直接减少氨的挥发损失，延长铵态氮的持续供应时间。与普通尿素相比，NBPT增效剂尿素能显著增加春油菜的角果数和角粒数，春油菜折合产量为4 075.6 kg/hm²，较对照不施氮肥处理的增产2 425.6 kg/hm², 增产率为147.0%；较施氮135 kg/hm²处理的增产367.6 kg/hm²，增产率为9.9%^[4]。

赵略等^[5]研究了NBPT对土壤中脲酶活性和细菌、放线菌生长及发酵产酶的影响，结果表明：NBPT的质量分数为0.1%~0.5%时，对土壤中脲酶的活性影响较小；当NBPT的质量分数达到1.0%时，对氨的挥发抑制效果最显著；低质量浓度(0.1 mg/mL)的NBPT对细菌等菌种的生长有一定的促进作用，但是中等质量浓度和高质量浓度处理组表现出了菌种生长受到抑制的现象；NBPT对放线菌、细菌的产酶有非常明显的抑制效果，最大抑制率分别为55.5%和67.2%。

当前对脲酶抑制剂的研究，有些侧重于农作物的产量、土壤铵含量和氨挥发等方面，有些则侧重于抑制剂的作用机制，结果都表明脲酶抑制剂在抑制尿素水解、提升氮肥利用率方面具有显著效果。脲酶抑制剂是化学试剂，存在生产成本高、价格高、田间降解能力弱、对作物有化学污染等缺点，如HQ不仅价格较贵，而且有毒，人食用5 g即可致死，需慎重考虑其生物安全性。

脲酶抑制剂多为有机化合物，受环境影响较大，施用上具有一定的局限性，在选择脲酶抑制剂时，需了解土壤的状况和周围的环境情况。因此，寻找一种既可起到抑制脲酶活性和尿素水解，又适用于大多数土壤，且对环境友好的化合物成为一种需求。

1 研究方法

1.1 脲酶晶体结构准备

从PDB数据库(https://www.rcsb.org)获取4gy7菜豆脲酶的晶体结构。利用PyMOL软件，保留蛋白的A链和C链，除去其他链和水分子。在AutoDock 4.2软件中，将准备好的pdb格式文件添加氢原子并对氨基酸残基进行补齐，计算电荷，设置原子类型为Assign AD4 type。利用PyMOL软件，从蛋白晶体复合物中提取出共晶配体，以该配体所在的双镍活性位点作为活性中心，打开pdb格式文件，设置Grid参数，以蛋白的活性位点为中心；设置x=50、y=50、z=50，x、y、z分别表示在各方向上格点的数量；Spacing设置为0.3×10^-10 m，设置完成后保存为grid.gpf格式文件。

1.2 天然产物活性小分子结构准备

通过ZINC数据库下载天然化合物，先使用ChemDraw软件绘制出单体化合物的结构，再用Caculations-MM2-Minimize Energy模块对小分子化合物进行能量优化，并保存成mol2格式。在Autodock软件的Read Molecule中，选择mol文件并打开后，导入配体小分子。将mol2格式批量转换为pdbqt格式。

1.3 分子对接准备

在AutoDockTools中的Docking模块打开保存好的pdbqt格式文件，定义配受体，Search Parameters选择遗传算法(Genetic Algorithm)，Number of GA Runs设置为10，Maximum Number of Evals设置为250 000，其他参数为默认，输出文件保存为dock.dpf格式文件，通过run AutoDock生成dlg格式文件。在AutoDockTools的Analyze板块中对dlg格式文件进行分析，保存最优构象后输出pdb格式文件。

1.4 相互作用能分析

将分子对接获得的最佳分子构象pdb格式文件进行MM-PBSA分子间相互作用力分析，并与脲酶抑制剂NBPT和HQ、(2-硝基苯基)-磷酸三酰胺(2-NPT)和ZINC数据库化合物等进行分子间作用力评估，评估的结果以结合能数据表示。

2 模拟结果

2.1 脲酶晶体和小分子结构准备

菜豆脲酶为三聚体蛋白质，晶体结构去除水分子后，仅保存A、C链，A、C链各包含840个氨基酸，菜豆脲酶的分子结构见图 1，氨基酸序列见图 2。活性中心根据原配体所在位置，删除原有配体，选取原有配体及双镍活性中心9×10^-10 m范围内的腔体作为活性中心，见图 3。

图 1

菜豆脲酶的分子结构

图 2

菜豆脲酶氨基酸序列

图 3

双镍活性中心

小分子配体准备：经ZINC数据库分析，累计下载9 617个小分子，同时下载尿素、NBPT、HQ、2-NPT的分子作为对照，所有小分子通过分子动力学软件进行能量最小化优化。

2.2 配体半柔性分子对接

使用经能量最小化优化后的小分子与脲酶蛋白晶体结构进行半柔性分子动力学优化，再经MM-GBSA进行相互作用的结合能分析。尿素、NBPT、HQ、2-NPT与脲酶相互作用的平均结合能依次为30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol，见表 1；作用的主要氨基酸及金属催化中心为Ni1、Ni2、ALA A: 440、ASP A: 633、GLY A: 550、HIS A: 409、ALA A: 636、KCX A: 490、HIS A: 492、HIS A: 519、HIS A: 593、ARG A: 609、MET A: 637、CME A: 592等，作用的类型主要为范德华力、氢键、金属配位、电荷吸引力等，见图 4~7。

表 1

尿素和常用脲酶抑制剂与脲酶相互作用的结合能 kJ/mol

项目	结合能										平均结合能
项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均结合能
尿素	31.11	30.86	30.63	31.34	31.09	30.91	30.70	30.86	30.66	30.96	30.91
NBPT	36.65	33.72	37.37	34.84	33.83	36.94	29.61	29.08	29.71	27.40	32.92
HQ	27.91	28.58	28.95	29.21	28.40	27.13					28.36
2-NPT	30.85	15.18	25.40	23.43	19.63	13.08	16.51	5.38	15.64	21.18	18.63

图 4

尿素与脲酶抑制剂作用情况分析

图 5

NBPT与脲酶抑制剂作用情况分析

图 6

2-NPT与脲酶抑制剂作用情况分析

图 7

HQ与脲酶抑制剂作用情况分析

2.3 基于ZINC数据库的有效产物筛选

使用ZINC数据库，共下载9 617个小分子，再经Minimize Energy处理，得到优化后的小分子，赋予charmm力场。优化后的小分子和脲酶蛋白晶体结构经过半柔性分子动力学优化，获得5 883个小分子具有可能的结合能力；然后经MM-GBSA相互作用能分析，以平均结合能大于55 kJ/mol的分子作为考察对象，见表 2。

表 2

平均结合能大于50 kJ/mol的潜在化合物

序号	ZINC数据库编号	平均结合能/(kJ·mol^-1)	CAS号
1	ZINC000001594203	65.859 5	75-75-2
2	ZINC000004228276	64.566 7	498-40-8
3	ZINC000003869280	63.926 4	73913-63-0
4	ZINC000003869933	62.408 0	820-11-1
5	ZINC000066331607	62.057 0	14235-54-2
6	ZINC000001574931	62.056 1	27530-80-9
7	ZINC000004095907	62.034 2	626-69-7
8	ZINC000024492326	61.335 6	57-04-5
9	ZINC000002567965	60.584 5	504-33-6
10	ZINC000003869279	60.562 8	3913-50-6
11	ZINC000002545126	60.378 4	504-33-6
12	ZINC000003869231	60.233 5	1334-74-3
13	ZINC000003869281	60.184 8	73913-63-0
14	ZINC000003873028	60.118 1	76483-21-1
15	ZINC000003830897	59.318 2	819-83-0
16	ZINC000004096823	59.303 7	98022-26-5
17	ZINC000001659811	59.260 2	7365-82-4
18	ZINC000038615690	58.777 8	34730-59-1
19	ZINC000005783646	58.727 3	23783-26-8
20	ZINC000038615690	58.388 9	34730-59-1
21	ZINC000100006629	58.301 2	551-68-8
22	ZINC000031302390	58.231 4	23783-26-8
23	ZINC000247664325	58.211 6	14696-74-3
24	ZINC000003830895	58.015 1	57-03-4
25	ZINC000001574932	57.810 4	1114-81-4
26	ZINC000005131814	57.331 9	4084-27-9
27	ZINC000005131953	56.992 0	35396-47-5
28	ZINC000001850486	56.593 4	29454-16-8
29	ZINC000003869793	56.556 8	6322-07-2
30	ZINC000003872713	56.376 1	1071-83-6
31	ZINC000001656225	55.591 6	279-24-3
32	ZINC000021982840	55.371 5	64205-92-1
33	ZINC000013525808	55.323 0	4134-97-8
34	ZINC000003809490	55.185 3	107-35-7
35	ZINC000018152608	55.019 1	7776-48-9

3 讨论

3.1 尿素、NBPT、HQ、2-NPT分子对接

通过分子对接，结果显示：尿素、NBPT、HQ、2-NPT与脲酶相互作用的平均结合能依次为30.91、32.92、28.36、18.63 kJ/mol，平均结合能数据表现为NBPT＞HQ＞2-NPT，NBPT的效果最优。徐丽萍等^[6]的研究发现，NBPT能抑制酰胺态氮的水解，降低氨挥发量，其中在潮土中NBPT的抑制作用最显著，在红壤中的抑制作用最弱，可能是因为NBPT在酸性土壤中的降解导致抑制效果减弱。宁国辉等^[7]发现，NBPT对于抑制尿素在土壤中的水解比HQ或P-苯醌更有效。HQ对NH₃⁺的挥发抑制作用最小，可能与其对硝化作用的抑制有关，与土壤环境因素无关。HQ的作用不仅在于延缓尿素的水解和减少氨的挥发，更重要的是影响了尿素水解产物进一步转化的过程^[8]。2-NPT作为新型脲酶抑制剂，具有较高的有效性，对脲酶的作用也具有耐久效应^[9]。俄罗斯于2016年发布了《采用高效液相色谱法测定尿素和含尿素肥料中的N-(2-硝基苯基)磷酸三酰胺(2-NPT)》的标准，为后期的化合物设计提供了依据，同时需严格规避化合物的毒理作用，避免对人或作物产生毒害作用，开发天然、环保、毒副作用小的脲酶抑制剂是环保、作物高效利用的关键。

3.2 新型脲酶抑制剂的虚拟筛选

ZINC数据库中共下载9 617个小分子，经Minimize Energy处理得到优化后的小分子，赋予charmm力场，通过分子动力学优化、MM-GBSA分析，获得5 883个小分子与脲酶可能产生相互作用。表 2中所示化合物平均结合能大于55 kJ/mol，优于尿素、NBPT、HQ的结合能，在相互作用能层面上具有较好的结果，结合的活性位点与DMPP、NBPT等具有相同点，可在后期针对结构位点进行深度的虚拟突变和化合物分子骨架延长设计。

4 结语

通过对脲酶晶体结构、尿素与脲酶的结合以及NBPT、HQ等常规脲酶抑制剂进行分子对接处理，结果表明：NBPT效果优于HQ和2-NPT，作为脲酶抑制剂可对尿素产生有效的竞争；对于ZINC数据库中9 617个筛选出的小分子，5 883个小分子具有与脲酶相互作用的关系，其中平均结合能大于55 kJ/mol的分子共35个，可与尿素、NBPT等产生竞争作用。本次筛选到的小分子为已有化学物质，未经过结构的修饰，即能够满足实际的试验验证和环境评价。计算机辅助模拟筛选脲酶抑制剂是一种引用药物设计的新型抑制剂筛选的方式，也是在农业领域的初次试探性使用，基于当前分子骨架延伸设计，以期为脲酶抑制剂的开发、环境保护、作物所需元素的高效利用提供新思路。

基于分子对接寻找酶抑制剂的方法一直是新药开发的重点，中盐安徽红四方肥业股份有限公司通过与高校院所产学研合作，持续性地在肥料领域加强科研攻关力度，通过先进的筛选方法，快速有效地提升脲酶抑制剂的筛选速度；通过开展实验室测定、田间试验示范，验证了不同增效剂在氮肥增效上的应用价值。后期将进行相关理论数据的补充验证，寻找成本低、稳定性好、自然环保的脲酶抑制剂，持续性地推进脲酶抑制剂在氮肥增效上的应用与开发。

ckwx 参考文献

李学红, 李东坡, 武志杰, 等. 脲酶/硝化抑制剂在黑土和褐土中对尿素氮转化的调控效果[J]. 应用生态学报, 2021, 32(4): 1352-1360.

张惠, 王志国, 张晴雯, 等. 抑制剂NBPT/DCD不同组合对灌区碱性灌淤土中氨挥发及有效氮积累量的影响[J]. 农业环境科学学报, 2015(3): 606-612.

邢卫, 陈利军, 陈振华, 等. NBPT与DMPP不同剂量组合对尿素氮转化的影响[J]. 土壤通报, 2008, 39(4): 896-899. doi:10.3321/j.issn:0564-3945.2008.04.043

康永泰, 孙艳霞, 姚立群, 等. NBPT增效剂尿素在高海拔灌区春油菜施用效果初报[J]. 甘肃农业科技, 2017(10): 53-55.

赵略, 孙庆元, 于英梅, 等. 脲酶抑制剂nBPT对土壤脲酶活性和脲酶产生菌的影响[J]. 大连轻工业学院学报, 2007, 26(1): 24-27.

徐丽萍, 王旭, 侯晓娜, 等. 脲酶抑制剂NBPT对三种类型土壤中UAN氮溶液氮素转化和氨挥发的影响[J]. 中国土壤与肥料, 2022(3): 126-136.

宁国辉, 刘树庆, 张笑归. 脲酶抑制剂的研究进展[J]. 河北农业大学学报, 2003(增刊1): 137-138.

张志明, 武冠云, 李荣华, 等. 脲酶抑制剂氢醌提高尿素肥效的研究[J]. 土壤通报, 1987(5): 214-216.

吴嘉圣, 陈炯明, 徐立, 等. 一种氮肥增效剂N-苯基磷酰三胺的合成[J]. 广东化工, 2012, 39(18): 43-44.