黄河三角洲盐碱地耐盐促生菌株的筛选与功能评价

Screening and Functional Evaluation of Salt Tolerant and Growth Promoting Strains in Saline Alkali Land of the Yellow River Delta

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2024.02.003

王春涛 Chuntao WANG , 张广忠 Guangzhong ZHANG , 徐勤政 Qinzheng XU , 王金夫 Jinfu WANG , 马瑞成 Ruicheng MA , 卢运艳 Yunyan LU , 解学仕 Xueshi XIE , 周丽 Li ZHOU

1 史丹利农业集团股份有限公司山东临沭 276700 Stanley Agricultural Group Co., Ltd., Linshu, Shandong 276700, China 2 山东省绿色肥料技术创新中心山东临沭 276700 Shandong Provincial Green Fertilizer Technology Innovation Center, Linshu, Shandong 276700, China

摘要：

通过对黄河三角洲盐碱地植物根际土壤的筛选，获得47株耐盐菌株，其中9株具有促生效果。结合产酸、耐碱、耐不同盐碱土的能力，最终获得1株耐盐菌株GJY-3。GJY-3在氯化物盐土、硫酸盐土、重碳酸盐土中的耐受程度分别为5%、5%、1%，酸碱耐受范围为3.15~10.5，无机磷溶解量为16.71 mg/L，吲哚乙酸的合成能力为31.33 mg/L，同时具备固氮、解钾功能。通过生理生化分析和16s rDNA鉴定，确定该菌株为地衣芽孢杆菌。通过盆栽试验发现：GJY-3在氯化钠盐碱土的促生效果优于硫酸钠盐碱土的；小白菜产量以及土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶活性分别增加17.54%、91.59%、32.24%、5.11%。试验结果表明，GJY-3可用作盐碱地土壤改良菌株。

关键词：

耐盐菌株; 盐碱地; 土壤改良; 地衣芽孢杆菌; 酶活性; 筛选; 功能评价;

Abstract：

By screening the rhizosphere soil of plants in the saline alkali land of the Yellow River Delta, 47 salt tolerant strains are obtained and of which 9 strains have a promoting effect on growth. By combining the abilities of acid production, alkali resistance, and tolerance to different saline alkali soils, one salt tolerant strain GJY-3 is finally obtained. The tolerance of GJY-3 in chloride soil, sulfate soil and bicarbonate soil is 5%, 5%, and 1%, respectively. The acid-base tolerance range is 3.15-10.5, the inorganic phosphorus dissolution amount is 16.71 mg/L, and the synthesis ability of indoleacetic acid is 31.33 mg/L. The strain also has nitrogen fixation and potassium solubilization functions. Through physiological and biochemical analysis and 16s rDNA identification, the strain is identified as Bacillus licheniformis. The pot experiment show that GJY-3 has a better promoting effect on growth in sodium chloride saline alkali soil than in sodium sulfate saline alkali soil. The yield of pakchoi and the activities of soil urease, sucrase, and catalase increased by 17.54%, 91.59%, 32.24%, and 5.11%, respectively. The experimental results indicate that GJY-3 can be used as a strain for improving saline alkali soil.

Keyword：

salt tolerant strain; saline alkali land; soil improvement; Bacillus licheniformis; enzyme activity; screening; functional evaluation;

我国盐渍化土壤面积大、分布广，主要集中在西北、华北、东北、沿海等地区。据相关统计，我国盐渍化土壤面积约为52亿亩(1亩=667m²)，其中已开垦及用作耕地的土壤仅占16.53%。为了保障全球粮食作物产量以及环境效益的可持续增长，盐碱地改良与应用具有重要的意义^[1-2]。

利用安全环保的生物法改良盐碱地已成为当前研究的重点。生物法主要包括耐盐植物法、耐盐微生物法等，其中耐盐微生物法更是受到了研究者的关注^[3-4]。大量研究表明，部分耐盐微生物具有刺激作物生长的效果。刘萧湘^[5]筛选获得的Bacillus sp.耐盐菌株YL4，不仅具有促生效果，而且可以降低土壤含盐量。孙晓莹等^[6]筛选获得的油菜假单胞菌YZX4具有促进白菜(小黄白)发芽的效果。

黄河三角洲盐碱地土壤自西向东呈梯次分布，覆盖轻度、中度和重度等3种盐碱地类型，是滨海盐碱地的典型代表，具有很高的研究和利用价值。根据盐碱地形成的方式不同，可将盐碱地分为氯化物盐土、硫酸盐土、重碳酸盐土。盐碱地改良菌株不仅需有较强的耐盐能力，而且应具备改良土壤、直接或间接刺激作物生长的作用，但目前大部分文献的评价方法较为单一，评价指标不够全面，或仅对菌株的耐盐性进行评价，较难获得优良的盐碱地改良菌株。

本文从当地土壤进行筛选，先对菌株的促生效果进行评价，然后分析了菌株对不同盐碱地的耐受能力及耐酸碱范围，再通过盆栽试验验证肥效，最终获得一株广谱性耐盐促生菌株GJY-3，可为耐盐微生物菌剂的研发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

土壤样品取自滨州沾化地区、东营河口区盐碱地盐地碱蓬、柽柳、玉米、冬枣等植物的根际土壤，以及当地不同盐碱程度的常规盐碱土壤。

1.1.2 培养基

基础培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，用去离子水定容至1 000 mL。

筛选培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠30 g，琼脂粉20 g，用去离子水定容至1 000 mL。

耐盐固体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，琼脂粉20 g，加入对应的盐溶液母液(见表 1)，定容至1 000 mL，得到的培养基含盐质量分数分别为3%、5%、10%。

表 1

不同盐碱土盐溶液母液的配制

盐碱土类型	m(Na₂SO₄)/g	m(NaCl)/g	m(NaHCO₃)/g	定容体积/mL	w(盐溶液母液)/%
硫酸盐土	151.63	12.49	35.88	1 000	20
氯化物盐土	17.23	141.99	40.78	1 000	20
重碳酸盐土	12.92	10.65	76.43	1 000	10

耐碱固体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉20 g，利用NaOH调节培养基pH分别为8.5、9.5、10.5，用去离子水定容至1 000 mL。

NBRIP溶磷培养基：葡萄糖10 g，磷酸三钙5 g，硫酸铵0.1 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.25 g，七水氯化镁5 g，用去离子水定容至1 000 mL，pH为6.8~7.0。

解钾培养基：蔗糖10 g，酵母粉0.5 g，七水合硫酸镁0.5 g，硫酸铵1 g，磷酸氢二钠2 g，碳酸钙1 g，钾长石粉1 g，琼脂20 g，用去离子水定容至1 000 mL，pH为7.0。

1.1.3 主要仪器及试剂

主要仪器：HZQ-S200型全温振荡箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；MJX-250B型生化培养箱、YXQ-70A型高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TU-1810型分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计，上海雷磁仪器有限公司；Centrifuge 5427 R型离心机，德国Eppendorf公司。

主要试剂：ADF培养基，上海仁捷生物科技有限公司；吲哚乙酸(IAA)标准品，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；Ashby无氮培养基，上海康朗生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 耐盐菌株的筛选

称取10 g采集的土壤样品，捣碎后放入带玻璃珠且装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，振荡均匀后，取样品1 mL，放入已灭菌的10 mL试管内，加入适量基础培养基，于30℃、180 r/min振荡培养2~3 d；涂布筛选培养基，将能在筛选培养基中生长繁殖的菌株进行分离纯化。

1.2.2 耐盐菌株的促生能力评价

固氮能力定性检测：挑取单菌落点接到Ashby无氮培养基上，然后倒置在28 ℃生化培养箱中培养4~5 d，观察其生长情况，判断能否在无氮培养基上正常生长。

溶磷效果评价：将菌株接种于NBRIP溶磷培养基中，以未接菌的NBRIP溶磷培养基为空白对照，于30 ℃、180 r/min振荡培养4~5 d；将培养液在转速11 000 r/min的条件下离心分离5 min后，取上清液，用钼锑抗比色法测定速效磷含量^[7]。

解钾能力定性评价：采用牛津杯法，每个孔上样发酵液30 μL，培养2 d后观察有无透明圈现象产生，有透明圈说明具有解钾功能。

IAA含量测定：参考文献[8]。

ACC脱氨酶活性测定：耐盐菌株培养至对数生长期后取其菌悬液，离心洗涤2次，将菌体涂布在ADF培养基上，观察其生长情况。

1.2.3 耐盐菌株的耐盐碱性及产酸能力评价

耐盐碱性评价：将分离获得的耐盐菌株分别在3%、5%、10%不同类型盐含量平板上进行分区划线，置于35 ℃生化培养箱内培养3 d，若有菌落出现，说明菌株可在该盐浓度下生长，将菌株可生长的最高盐浓度确定为最高盐含量耐受浓度；将分离获得的耐盐菌株在pH分别为8.5、9.5、10.5的碱性平板上进行分区划线，置于35 ℃生化培养箱内培养3 d，记录菌株的生长状态，判断其耐碱性。

产酸能力评价：将待测菌株接种到NBRIP溶磷培养基中，置于35 ℃生化培养箱内培养48 h后，检测pH变化，作为产酸能力的评价依据。

1.2.4 菌株鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株的形态、生理及生化特征分析^[9]。细菌发酵液由北京睿博兴科生物技术有限公司采用通用引物进行测序，在实验室内进行测序结果的BLAST序列对比分析，采用MEGA 6.0软件通过邻近法构建进化树。

1.2.5 盆栽试验效果验证

盆栽试验共设置4个处理，分别为NaCl对照(CK1)处理、Na₂SO₄对照(CK2)处理、NaCl+GJY-3处理(T1)、Na₂SO₄+GJY-3处理(T2)，每个处理重复6次。具体试验方法：将大田土壤过2 mm筛后装入1.5 L花盆中，施入普通复合肥(15-15-15)0.6g；4个处理分别用2%(质量分数，下同)NaCl盐溶液和2%Na₂SO₄盐溶液一次性浇透，并种植小油菜；T1、T2处理在苗期冲施GJY-3发酵液(150亿cfu/mL)2次，每次20 mL，CK1、CK2处理用等量清水代替；小油菜在温室大棚内生长50 d后，统计地上部鲜质量，检测土壤pH、可溶性盐浓度(EC值)以及蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶的活性。土壤pH采用电位法测定，EC值采用电导仪法测定，脲酶活性采用扩散法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，蔗糖酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定^[10-12]。

1.2.6 数据处理

采用Excel 2020软件进行数据统计，SPSS 20.0软件进行数据分析，Duncan新复极差法进行方差分析(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 耐盐菌株的筛选

以30g/L氯化钠溶液为筛选条件，从黄河三角洲地区15份土壤样品中筛选获得47株耐盐菌株，根据菌株的来源不同，命名为根际耐盐菌(GJY)及常规盐碱土壤耐盐菌(CGY)系列。

2.2 耐盐菌株的促生能力评价

对筛选获得的47株耐盐菌株进行固氮、溶磷、解钾功能以及ACC脱氨酶活性、IAA合成能力评价，具有2种以上功能的菌株共9株(见表 2)，其中GJY-3不仅具有上述功能，而且溶磷能力和IAA合成能力最强，分别为16.71 mg/L和31.33 mg/L。

表 2

耐盐菌株的促生能力评价

菌株名称	固氮能力	无机磷溶解量/(mg·L^-1)	解钾能力	ACC脱氨酶活性	IAA合成能力/(mg·L^-1)
GJY-3	++	16.71±0.14	++	+	31.33±0.11
CGY-4	+	10.53±0.23	+	ND	5.26±0.12
CGY-10	+	2.24±0.09	ND	+	17.65±0.18
CGY-3	+	5.35±0.09	+	+	ND
GJY-32	+	1.34±0.11	+	ND	ND
GJY-15	+	7.65±0.14	++	ND	ND
GJY-12	ND	1.42±0.14	+	ND	ND
GJY-9	+	ND	+	ND	ND
CGY-7	++	ND	+	ND	ND
注：1)ND表示未检出，+表示可在不同培养基中生长，++表示菌株可以快速生长

2.3 耐盐菌株的耐盐碱及产酸能力评价

选取的7株促生菌株表现出不同的耐盐碱能力，见表 3。有3株菌株能在3%氯化物、3%硫酸盐、1%重碳酸盐的盐碱土生长，分别为CGY-4、CGY-10、CGY-3；有2株菌株能在5%氯化物、5%硫酸盐、1%重碳酸盐的盐碱土生长，分别为GJY-3、GJY-32；有1株菌株能在5%氯化物、5%硫酸盐、5%重碳酸盐的盐碱土生长，为GJY-15；GJY-12表现出较强的盐耐受性，能在5%氯化物、10%硫酸盐、1%重碳酸盐的盐碱土生长。7株菌株均表现出耐碱能力，耐碱范围为pH 9.5~10.5。

表 3

7株耐盐菌株的耐盐碱能力评价

菌株名称	w(氯化物)/%	w(硫酸盐)/%	w(重碳酸盐)/%	耐碱能力(pH)
GJY-3	5	5	1	10.5
CGY-4	3	3	1	10.5
CGY-10	3	3	1	10.5
CGY-3	3	3	1	9.5
GJY-32	5	5	1	9.5
GJY-15	5	5	5	10.5
GJY-12	5	10	1	10.5

不同菌株均表现出产酸能力(见图 1)：pH＜4的菌株为GJY-3，pH为4~5的菌株有4株，pH为5~6的菌株有2株。

图 1

7株耐盐菌株的产酸能力评价

综上所述，GJY-3具有一定的促生功能，同时可在不同盐碱土中生长，可作为优良的盐碱地土壤改良菌株。

2.4 GJY-3菌株鉴定

GJY-3的菌体为长杆状，呈革兰氏阳性；在耐盐碱固体培养基上，菌落呈不规则状，表面较为干燥，菌落为白色；可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖，接触酶阳性。GJY-3的生理生化特征见表 4。

表 4

GJY-3的生理生化特征

鉴定指标	鉴定结果
革兰氏染色	+
厌氧生长	+
柠檬酸盐	+
接触酶	+
乙酰甲基甲醇(VP试验)	+
明胶水解	+
淀粉水解	+
硝酸盐还原	+
发酵葡萄糖产气	-
葡萄糖	+
阿拉伯糖	+
木糖	+
注：1)+代表阳性，-代表阴性

测序结果显示GJY-3的16s rRNA序列长度为1 508 bp，经BLAST序列比对以及利用Custalx和MEGA 6.0构建系统发育树(图 2)，该菌株与Bacillus licheniformis strain DSM 13(NR_118996.1)的相似度最高为99%，同时系统进化树上的关系最近。根据GJY-3的生理生化特征、菌落形态以及16s rRNA鉴定结果，可认定其为地衣芽孢杆菌。

图 2

GJY-3及相关菌株16srRNA序列的系统发育树

2.5 盆栽试验效果验证

由图 3(图中不同小写字母表示处理间差异显著，P＜0.05)可以发现，GJY-3在氯化物盐土和硫酸盐土中均能促进小油菜的生长。在氯化物盐土中，T1处理的小油菜地上部单株鲜质量为24.12 g，较CK1处理的增加17.54%，方差分析达到显著差异水平；在硫酸盐土中，T2处理的小油菜地上部单株鲜质量与CK2处理的差异不显著。

图 3

不同处理的小油菜地上部单株鲜质量

由表 5可以发现：GJY-3可显著降低氯化物盐土的pH和EC值，显著提高土壤中脲酶、蔗糖酶的活性，分别为3.44%、14.11%、91.59%、32.24%；在硫酸盐土中，GJY-3可显著降低土壤的EC值，提高土壤中的脲酶、蔗糖酶活性，分别为7.89%、42.83%、10.79%。

表 5

不同处理的土壤指标检测结果

处理	pH	EC值/(mS·cm^-1)	脲酶活性/(mg·g^-1·d^-1)	蔗糖酶活性/(mg·g^-1·d^-1)	过氧化氢酶活性/(mL·g^-1·h^-1)
CK1	7.85±0.07 a	2.48±0.02 a	0.428±0.102 b	5.438±0.593 b	3.095±0.033 a
CK2	7.65±0.06 b	2.28±0.07 b	0.558±0.036 b	6.309±0.616 ab	3.128±0.175 a
T1	7.58±0.04 b	2.13±0.09 c	0.820±0.131 a	7.191±0.371 a	3.253±0.164 a
T2	7.53±0.07 b	2.10±0.09 c	0.797±0.096 a	6.990±0.152 a	3.324±0.051 a
注：1)同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)

3 结语

陆洪省等^[13]从黄河三角洲盐碱地土壤中分离得到1株耐高盐菌株NM-1，该菌株耐盐(NaCl)质量分数达到30%，属于中度嗜盐微生物，鉴定结果为耐盐单胞菌属，但未对其促生效果进行评价。本文分离获得的菌株GJY-3具有ACC脱氨酶活性以及较高的产IAA能力。ACC脱氨酶通过将乙烯合成的前体物质ACC分解成氨和α-丁酮酸的方式降低乙烯含量，间接促进植物的生长^[14]。IAA可增强植物抗氧化酶系统的活性，降低高渗透压，减少盐胁迫对植物生长的抑制作用^[15]。GJY-3菌株还可以平衡土壤养分含量，促进作物对养分的吸收。

GJY-3菌株在氯化物盐土、硫酸盐土、重碳酸盐土中的耐受性分别为5%、5%、1%，说明GJY-3是一株广谱耐盐菌。耐盐强的菌株，其功能性往往较差。研究发现，GJY-3具有较强的产酸能力和无机磷溶解能力，两者具有相关性，这与孙晓莹等^[6]的研究结果较一致。

刘彩霞^[16]的研究发现，以氯化物为主要成分的盐碱土肥力低下，盐分抑制了土壤中蔗糖酶、脲酶、过氧化物酶的活性，盐碱土中真菌及放线菌的数量较少，细菌是其中的优势种群。通过盆栽试验发现，GJY-3可降低土壤含盐量，具有提高土壤酶活的作用，这与燕红等^[17]、曲发斌等^[18]的研究结果较为一致，但降盐机理需作进一步的研究。

经鉴定，GJY-3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，但该菌株与其他菌株的复配效果及用于发酵制备生物有机肥以改良盐碱地的功效需作进一步的研究。

ckwx 参考文献

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