超高速全自动氨基酸分析仪法测定水溶肥料中聚谷氨酸的含量

Determination of Polyglutamic Acid Content in Water-Soluble Fertilizer by Ultra-High Speed Fully Automatic Amino Acid Analyzer Method

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2025.02.016

邓艺萍 Yiping DENG , 张思敏 Simin ZHANG , 吴琼婧 Qiongjing WU

广西壮族自治区分析测试研究中心广西南宁 530022 Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Analysis and Test Research, Nanning, Guangxi 530022, China

Author notes:

Correspondence to: 张思敏(1985—)，男，硕士，高级工程师，主要从事大型精密仪器在肥料、食品、饲料、土壤、水质等领域的分析检测与课题研究工作；43985449@qq.com

摘要：

提出了超高速全自动氨基酸分析仪法测定水溶肥料中聚谷氨酸含量的方法。将含聚谷氨酸水溶肥料分别进行水解处理和用超纯水提取，在选择的仪器工作条件下，采用单点外标法，用超高速全自动氨基酸分析仪测定水解谷氨酸和游离谷氨酸的含量，两者的差即为聚谷氨酸的含量。方法的检出限为0.004 8 nmol/mL，测定结果的相对标准偏差(n=10)为0.68%~3.73%，测定值与认定值之比为96.2%~106.0%。

关键词：

聚谷氨酸; 水溶肥料; 氨基酸分析仪; 分析测定;

Abstract：

A method for determining the content of polyglutamic acid in water-soluble fertilizer using an ultra-high speed fully automatic amino acid analyzer is proposed. Water-soluble fertilizer containing polyglutamic acid is respectively subjected to hydrolysis treatment and extraction with ultra-pure water. Under the selected instrument operating conditions, a single point external standard method is used to measure the content of hydrolyzed glutamic acid and free glutamic acid using a ultra-high speed fully automatic amino acid analyzer. The difference between the two is the content of polyglutamic acid. The detection limit of the method is 0.004 8 nmol/mL, the relative standard deviation (n=10) of the measurement results is 0.68% to 3.73%, and the ratio of the measured value to the actual value is 96.2% to 106.0%.

Keyword：

polyglutamic acid; water-soluble fertilizer; amino acid analyzer; analysis and determination;

聚谷氨酸作为一种重要的生物活性物质，在农业领域的用途主要包括：①提高肥料利用率。聚谷氨酸凭借独特的化学立体结构^[1]，能够增强土壤对有效养分的吸附能力^[2]，使土壤中的有效养分不易流失^[3]，保持了土壤有效养分的稳定性^[4]，使水溶肥料中的有效养分更易于被植物吸收利用，从而提高肥料的利用率^[5]。②促进植物生长。聚谷氨酸能够刺激植物根毛的新生和根系的生长，根毛数量和长度的增加有利于根系对水分和养分的吸收^[6-7]，进而促进植物的生长和发育。这种综合效应使得植物在面临干旱、土壤贫瘠等情况时，仍能保持较高的生长速率和产量^[8]。③改善土壤环境。聚谷氨酸具有调节土壤酸碱度的作用^[9]，可保持土壤酸碱度在植物生长的适宜范围内，能够缓解因长期施用化肥导致的土壤酸化问题，为植物提供更好的生长环境^[10]。

目前，测定聚谷氨酸含量的方法有比色法、酶标仪快速测定法、氨基酸分析仪法等。比色法测定聚谷氨酸含量时，易受多种因素影响，误差较大，灵敏度受限，操作繁琐且重复性不理想^[11]。酶标仪快速测定法虽高效，但操作要求严格，易受环境因素干扰，且存在样本局限性和仪器维护成本高等不足^[12]。氨基酸分析仪法测定聚谷氨酸含量，操作简便，方法具有自动化程度高、灵敏度和分辨率强、选择性及专属性优、重现性好等优点^[13-14]。

本文利用超高速全自动氨基酸仪测定聚谷氨酸的含量，考查了方法的检出限、精密度，并以聚谷氨酸标准样品作为参照，通过与测定值进行比对，确保了测定结果的准确性和重复性。

1 试验部分

1.1 超高速全自动氨基酸分析仪法测定原理

将水溶肥料样品水解处理后的溶液和用超纯水提取后的溶液分别注入超高速全自动氨基酸分析仪中，通过特定的色谱柱对样品溶液中的氨基酸(包括谷氨酸分量)进行分离，利用检测器定量分析水解谷氨酸和用水提取的游离谷氨酸的含量，两者的差即为聚谷氨酸的含量。

1.2 试剂材料和仪器

1.2.1 主要试剂

二水合柠檬酸三钠、一水合柠檬酸、乙二醇甲醚、茚三酮、硼氢化钠、氢氧化钠、氯化钠、二水合乙酸锂、冰乙酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)、5-磺基水杨酸，均为分析纯；盐酸(质量分数≥36%)，优级纯；上述试剂购自国药集团化学试剂有限公司。无水乙醇，色谱纯，购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2.2 试剂配制

二水合柠檬酸三钠缓冲溶液[c(Na⁺)=0.2 mol/L]：称取19.6 g二水合柠檬酸三钠，加入500 mL水溶解后，再加入16.5 mL盐酸，用水稀释至1 L，混匀，用6 mol/L盐酸溶液和500 g/L氢氧化钠溶液调节pH至2.2。

氢氧化钠溶液(500 g/L)：称取500 g氢氧化钠用水溶解后，冷却，加水稀释至1 L，混匀。

盐酸溶液(6 mol/L)：量取500 mL盐酸加水稀释至1 L，混匀。

5-磺基水杨酸溶液(50 g/L)：称取50 g 5-磺基水杨酸用适量水溶解后，加水稀释至1 L，混匀。

EDTA-Na溶液(10 g/L)：称取10 g EDTA-Na用适量水溶解后，加水稀释至1 L，混匀。

1.2.3 标准品

谷氨酸标准储备溶液：含谷氨酸2.50 μmol/mL，经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液。

谷氨酸标准工作溶液：准确移取2.50 μmol/mL谷氨酸标准储备溶液0.40 mL于10 mL容量瓶中，用0.2 mol/L二水合柠檬酸三钠缓冲溶液定容，谷氨酸浓度为100 nmol/mL，在2~8 ℃下保存，有效期3个月。

1.2.4 主要仪器

LA8080型超高速全自动氨基酸分析仪、CR22G型高速冷冻离心机，日本日立株式会社；DGF30/14-11A型电热鼓风干燥箱，南京实验仪器厂；安瓿。

1.3 水溶肥料的前处理

1.3.1 试样的制备

固体试样缩分至约100.0 g，将试样快速研磨并全部通过0.50 mm孔径试验筛(如试样水分含量高，可通过1.00 mm试验筛)，混合均匀，置于干净、干燥的器皿中；液体试样摇匀后，快速取出约100 mL，置于干净、干燥的器皿中。

1.3.2 试样溶液的制备

1.3.2.1

水解谷氨酸溶液

称取0.5 g(精确至0.000 1 g)混匀的固体试样，置于安瓿中，加入6 mol/L盐酸溶液15 mL。对于液体试样，可先加入与取样量相同体积的盐酸混匀后，再用6 mol/L盐酸溶液补充至10 mL。安瓿接真空泵抽真空并充氮气，然后用酒精喷灯封口，放入(110±1) ℃的电热鼓风干燥箱水解22 h后，取出冷却，开管，滤纸过滤后，用检定过的移液枪移取滤液1.0 mL于玻璃蒸发皿中，在沸水浴锅上蒸至干，用0.2 mol/L二水合柠檬酸三钠缓冲溶液定容至10 mL，过0.45 μm有机滤膜，上机测定。

1.3.2.2

游离谷氨酸溶液

称取试样1.0 g(精确至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，超声并充分溶解后，用超纯水稀释至刻度，摇匀，室温静置过夜；分取过滤后的上清液2.00 mL于10 mL离心管中，准确加入50 g/L 5-磺基水杨酸溶液2.0 mL，混匀，放置1 h；准确加入10 g/L EDTA-Na溶液1.0 mL和0.06 mol/L盐酸溶液1.0 mL，混匀，离心15 min(或用0.45 μm的微孔滤膜过滤)；吸取上清液(或滤液)1.00 mL于玻璃蒸发皿中，在沸水浴锅上蒸至干，准确加入0.2 mol/L二水合柠檬酸三钠缓冲溶液1.0 mL复溶，过0.45 μm有机滤膜，上机测定。

1.4 测定

1.4.1 仪器工作条件

反应柱温度：(135±1.0) ℃；分离柱温度：(20~70) ℃±0.5 ℃；机内氮气压力：35~40 kPa。

泵Ⅰ流量：0.35 mL/min；泵Ⅱ流量：0.32 mL/min；Ⅰ通道检测波长：570 nm；Ⅱ通道检测波长：440 nm；进样量：20 μL。基线噪声(mV)：pH法CH1为0.023 7，CH2为0.046 5。流动相：各路流动相B1、B2、B3、B4、B6、RG、R1、R2、R3、B5、C1试剂配比见表 1。

表 1

流动相组成

流动相	二水合柠檬酸三钠/g	1 mol/L氢氧化钠溶液/mL	氯化钠/g	一水合柠檬酸/g	无水乙醇/mL	茚三酮/g	硼氢化钠/g	乙二醇甲醚/mL	乙酸锂/g	冰乙酸/mL	总体积/L
B1	6.19	6~7	5.66	19.80	135.0						1.0
B2	7.74	20~22	7.07	22.00	25.0						1.0
B3	13.31		3.74	12.80	9.0						1.0
B4	26.67		54.35	6.10							1.0
B6、RG		200			100.0						1.0
R1						40.0	0.081	1 000			1.0
R2								401	204	123	1.0
R3、B5、C1					50.0						1.0

1.4.2 试样测定

谷氨酸标准工作溶液和样品溶液分别以相同的体积注入超高速全自动氨基酸分析仪，以单点外标法通过峰面积计算样品溶液中氨基酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 检出限

根据我国计量检定规程《氨基酸分析仪检定规程》(JJG 1064—2011)中的检出限要求，按仪器工作条件设置各项参数，启动仪器待稳定后，测量浓度为5.0 nmol/mL的谷氨酸标准溶液3次，记录色谱图，由谷氨酸峰高平均值和基线噪声值平均值计算谷氨酸检出限C_L，结果见表 2。

表 2

仪器检出限

基线噪声值/mV				谷氨酸色谱峰峰高/mm				检出限C_L/(nmol·mL^-1)
测定值			平均值	测定值			平均值
1	2	3	平均值	1	2	3	平均值
0.042 6	0.050 4	0.046 4	0.046 5	1.917	1.940	1.975	1.944	0.004 8

试验结果表明，仪器能够检测到较低浓度的谷氨酸，根据JJG 1064—2011中对氨基酸分析仪检出限的检定要求，可以满足试验方法的检测要求。

2.2 样品分析结果

按照试验方法，对20个含聚谷氨酸水溶肥料试样进行了测定，结果见表 3。

表 3

试样测定结果

样品编号	测定值/(g·L^-1)	样品编号	测定值/(g·L^-1)	样品编号	测定值/(g·L^-1)	样品编号	测定值/(g·L^-1)
1	12.9	6	25.8	11	12.7	16	20.7
2	18.6	7	16.2	12	23.5	17	31.8
3	19.8	8	9.6	13	13.4	18	17.2
4	20.4	9	17.9	14	12.0	19	14.3
5	15.2	10	11.8	15	11.1	20	15.5

从表 3可看出，20个水溶肥料试样中均含有一定量的聚谷氨酸。

2.3 精密度试验

按照试验方法，分别对样品编号为8、16、17的含聚谷氨酸水溶肥料试样平行测定10次，结果见表 4。

表 4

精密度试验结果

样品编号	测定值/(g·L^-1)										平均值/(g·L^-1)	相对标准偏差/%
样品编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均值/(g·L^-1)	相对标准偏差/%
8	9.2	9.5	9.9	9.8	9.2	9.9	9.4	9.2	10.0	10.1	9.6	3.73
16	20.7	20.5	20.8	20.5	20.8	20.8	20.8	20.6	21.1	20.5	20.7	0.92
17	31.5	32.3	32.0	31.9	31.7	31.8	31.7	31.8	31.9	31.7	31.8	0.68

从表 4可看出，聚谷氨酸测定值的相对标准偏差为0.68%~3.73%，多次测定结果间的偏差较小，未出现异常值或明显偏离的情况，表明试验方法具有良好的可重复性和稳定性，能满足对方法精密度的要求。

2.4 准确度试验

按照试验方法，分别对3个已知聚谷氨酸含量的水溶肥料样品平行测定10次，测定值与已知值的比较见表 5。

表 5

测定值与已知值的比较

样品编号	平均值/(g·L^-1)	已知值/(g·L^-1)	测定值与已知值之比/%
8	9.6	10.0	96.0
16	20.7	20.0	103.5
17	31.8	30.0	106.0

从表 5可看出，测定值与已知值之比为96.2%~106.0%，表明测定值与已知值保持了良好的一致性，说明试验方法具有较高的准确度和可靠性。

3 结语

试验采用超高速全自动氨基酸分析仪法测定水溶肥料中聚谷氨酸的含量，方法具有操作步骤简单、灵敏度强、稳定性好、精密度高、准确度优等特点，适合大批次样品的分析测定。氨基酸分析仪法在水溶肥料检测等领域将有广阔的应用前景。

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