高效液相色谱法测定水溶肥料中的游离氨基酸

Determination of Free Amino Acids in Water-Soluble Fertilizers by High Performance Liquid Chromatography

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2025.05.013

兰尊海 Zunhai LAN , 薛宁 Ning XUE , 平会梦 Huimeng PING , 曹明月 Mingyue CAO , 李贤 Xian LI , 陈航 Hang CHEN , 兰剑 Jian LAN

1 河南牧业经济学院河南郑州 450046 Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou, Henan 450046, China 2 河南海瑞正检测技术有限公司河南郑州 450001 Henan Hairuizheng Detection Technology Co., Ltd., Zhengzhou, Henan 450001, China

Author notes:

Correspondence to: 兰剑(1995—)，男，大学本科，总经理，研究方向为饲料、肥料的检验检测；hrztest024@163.com

摘要：

提出了高效液相色谱法测定含氨基酸水溶肥料中游离氨基酸的含量。采用C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以2, 4-二硝基氟苯为衍生剂，由水、乙腈和0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液(含体积分数1%的N, N-二甲基甲酰胺，pH=6.4)组成的流动相进行梯度洗脱，流量为1.2 mL/min，检测波长为360 nm。结果表明：17种氨基酸的质量浓度在1~200 μg/mL范围内与对应的峰面积呈线性相关，决定系数R²均大于0.996，检出限为1~3 mg/kg，加标回收率为83.3%~108.5%，相对标准偏差(n=6)为0.7%~4.5%。高效液相色谱法分离效果好、准确度高，可满足含氨基酸水溶肥料中游离氨基酸的检测要求。

关键词：

水溶肥料; 游离氨基酸; 高效液相色谱法; 测定;

Abstract：

A method for determining the content of free amino acids in water-soluble fertilizers containing amino acid using high performance liquid chromatography (HPLC) is proposed. The analysis is performed on a C₁₈ column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) using 2, 4-dinitrofluorobenzene as the derivatization agent. Gradient elution is carried out with a mobile phase composed of water, acetonitrile, and 0.05 mol/L sodium acetate buffer solution (containing volume fraction 1% N, N-dimethylformamide, pH=6.4) at a flow rate of 1.2 mL/min. The detection wavelength is set at 360 nm. The results show that the mass concentrations of the 17 amino acids exhibited a linear relationship with their corresponding peak areas within the range of 1-200 μg/mL, with coefficients of determination (R²) all greater than 0.996. The detection limits ranged from 1 to 3 mg/kg, the spiked recovery rate are 83.3%-108.5%, and the relative standard deviations (RSD, n=6) are 0.7%-4.5%. The HPLC method demonstrates good separation efficiency and high accuracy, meeting the requirements for the determination of free amino acids in water-soluble fertilizers containing amino acid.

Keyword：

water-soluble fertilizer; free amino acid; high performance liquid chromatography (HPLC); determination;

含氨基酸水溶肥料是以游离氨基酸为主体，按适合植物生长所需的比例添加适量的微量元素所制成的液体或固体水溶肥料。作为植物的有机氮源，含氨基酸水溶肥料能促进蛋白质的合成，并调节促进植物的生长^[1-2]。近年来，随着含氨基酸水溶肥料在我国的迅速推广应用，其重要性日益突出^[3]。目前，测定肥料中游离氨基酸的含量常采用行业标准《水溶肥料游离氨基酸含量的测定》(NY/T 1975—2010)中的方法，包括氨基酸自动分析仪法和柱前衍生-液相色谱法。但该标准中未明确高效液相色谱法的具体检测条件，而柱前衍生方法有很多种，如邻苯二甲醛(OPA)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)和2, 4-二硝基氟苯(DNFB)等。不同的柱前衍生法在分离度、灵敏度、准确度和成本等方面差异较大，选择难度较高^[4-6]。氨基酸自动分析仪价格昂贵且专属性强，而高效液相色谱法测定肥料中的游离氨基酸则具有分析成本低、检测速率快、灵敏度和准确度高且操作简单、易于推广等优点^[7-11]。本文通过大量试验，优化了检测条件，旨在建立一种测定水溶肥料中游离氨基酸含量的高效液相色谱法。

1 试验部分

1.1 主要仪器设备和化学试剂

1.1.1 主要仪器设备

Waters2695型高效液相色谱仪，带紫外检测器和柱温箱，沃特世科技(上海)有限公司；BSA224S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；KQ-250D型超声波提取器，昆山市超声仪器有限公司；JW-2019HR型离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；DHG-9070型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；XK96-A/B型快速混匀器，江苏新康医疗器械有限公司；UPT-Ⅱ-20T型超纯水机，成都超纯科技有限公司。

1.1.2 主要化学试剂

17种氨基酸[天门冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、丝氨酸(ser)、精氨酸(arg)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)、脯氨酸(pro)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、蛋氨酸(met)、胱氨酸(cys)、异亮氨酸(lie)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、酪氨酸(tyr)]标准溶液，浓度均为1 mmol/L，中国计量科学研究院；磺基水杨酸(分析纯)，上海试剂一厂；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na, 分析纯)、碳酸氢钠(优级纯)，天津市德恩化学试剂有限公司；DNFB(优级纯)，德国塞尔瓦生物科技公司；无水乙酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；N, N-二甲基甲酰胺(色谱纯)、磷酸二氢钾(优级纯)，天津市大茂化学试剂厂；乙腈(色谱纯)，安徽时联特种溶剂股份有限公司；冰乙酸(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠(分析纯)，佛山西陇化工有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂溶液的配制

0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取0.40 g(精确至0.01 g)氢氧化钠，加入超纯水，超声溶解并定容至100 mL。

磷酸盐平衡缓冲溶液(pH=7.0)：称取0.68 g (精确至0.01 g)磷酸二氢钾于100 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液29.1 mL，用水定容，摇匀，抽滤，贮于棕色试剂瓶中，并于4 ℃冰箱中保存。

0.05 mol/L碳酸氢钠溶液(pH=9.0)：称取4.20 g(精确至0.01 g)碳酸氢钠，加100 mL超纯水溶解，抽滤，备用。

DNFB-乙腈溶液：称取1.00 g(精确至0.01 g) DNFB于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容。

0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液(含体积分数1%N, N-二甲基甲酰胺，pH=6.5)：称取3.40 g(精确至0.01 g)无水乙酸钠，加入800 mL超纯水、10 mL N, N-二甲基甲酰胺，用体积分数20%冰乙酸调节pH至6.5，经0.45 μm滤膜过滤，备用。

磺基水杨酸溶液(50 g/L)：称取50 g(精确至0.01 g)磺基水杨酸，加入超纯水，超声溶解后定容至1 000 mL。

EDTA-Na溶液(10 g/L)：称取10 g(精确至0.01 g)EDTA-Na，加入超纯水，超声溶解后定容至1 000 mL。

1.2.2 样品前处理

称取1~5 g(精确至0.000 1 g)水溶肥料样品于250 mL容量瓶中，加水超声溶解后定容；精确吸取2.00 mL滤液于试管中，准确加入磺基水杨酸溶液2 mL，混匀，静置1 h；再加入EDTA-Na溶液1 mL，混匀，经0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.2.3 衍生化反应

准确吸取氨基酸标准溶液和样品溶液各100 μL于小试管中，抽干；各加入0.05 mol/L碳酸氢钠溶液(pH=9.0)200 μL，混匀；再各加DNFB-乙腈溶液200 μL，混匀，密封；置于60 ℃电风鼓热干燥箱中衍生35 min，取出后放至室温，加入磷酸盐平衡缓冲溶液1 600 μL，混合均匀，供高效液相色谱分析。

1.2.4 仪器条件

色谱柱：YWC-Triart C₁₈，4.6 mm×250 mm，5 μm。流动相：A为水，B为乙腈，C为0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱比例见表 1。流量：1.2 mL/min，检测波长：360 nm，柱温：25 ℃，进样体积：10 μL。

表 1

梯度洗脱比例

时间/min	流动相A/%	流动相B/%	流动相C/%
0	8.0	8.0	84.0
0.3	8.0	8.0	84.0
4.0	15.5	15.5	69.0
9.5	18.0	18.0	64.0
17.0	27.5	27.5	45.0
28.0	30.0	30.0	40.0
34.0	40.0	60.0	0
38.0	40.0	60.0	0
39.0	8.0	8.0	84.0

2 结果与讨论

2.1 与NY/T 1975—2010中氨基酸自动分析仪法的对比

2.1.1 出峰时间

分别采用高效液相色谱法和氨基酸自动分析仪法对氨基酸水溶肥样品进行分析，出峰时间见图 1和图 2。结果显示，高效液相色谱法的出峰时间不超过37 min，氨基酸自动分析仪法的出峰时间则可达100 min左右。这表明高效液相色谱法的检测时间更短，大大提升了工作效率。

图 1

高效液相色谱法谱图

图 2

氨基酸自动分析仪法谱图

2.1.2 结果准确性

选用含游离氨基酸固体水溶肥和含游离氨基酸液体水溶肥两类肥料样品，分别采用高效液相色谱法和NY/T 1975—2010中的氨基酸自动分析仪法进行测定，结果见表 2。

表 2

两种方法测定游离氨基酸的结果

项目	固体水溶肥中游离氨基酸w/%		液体水溶肥中游离氨基酸w/%
项目	高效液相色谱法	氨基酸自动分析仪法	高效液相色谱法	氨基酸自动分析仪法
asp	2.12	2.09	0.82	0.80
glu	3.23	3.18	1.86	1.82
ser	0.77	0.76	1.36	1.33
arg	1.44	1.42	1.16	1.14
gly	1.55	1.53	0.55	0.54
thr	1.04	1.03	1.00	0.98
pro	1.05	1.03	1.07	1.05
ala	1.55	1.52	0.49	0.48
val	1.28	1.26	0.51	0.50
met	0.74	0.72	0.05	0.05
cys	0.20	0.19	0.19	0.19
lie	1.11	1.10	0.21	0.21
leu	1.79	1.76	0.47	0.46
phe	1.03	1.01	0.23	0.22
his	0.67	0.66	0.13	0.13
lys	1.94	1.91	0.41	0.40
tyr	0.73	0.71	0.11	0.11
游离氨基酸总和	22.24	21.88	10.62	10.41
差值	0.36		0.21

从表 2可以看出，两种方法所得结果的绝对差值分别为0.36%、0.21%，均满足标准要求的绝对差值≤1.0%。经深入研究发现，高效液相色谱法的测定结果准确度较高，且具有可行性。

2.2 试验条件的选择

2.2.1 衍生试剂

一般采用C₁₈键合硅胶材料为固定相，弱酸盐缓冲溶液和有机溶剂为流动相，在选择不同衍生化试剂的基础上建立柱前衍生化高效液相色谱法。同时，对OPA、Dansyl-Cl、AQC和DNFB进行对比，结果见表 3。在考虑试验差和成本的基础上，选择DNFB为衍生试剂。

表 3

不同衍生试剂的特点

试剂	衍生过程	优点	缺点
OPA	加热避光＜5 min	OPA衍生化方法具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高等优点, 而且试剂本身不发荧光，不会产生干扰	荧光强度较低且不稳定
Dansyl-Cl	加热避光60 min	衍生产物荧光强度高，灵敏度高，也可用紫外检测	反应较慢，衍生物至少需要50 min才能达到最大产率；衍生产物不太稳定，衍生产物荧光易因缓冲液淬灭，需在密闭和避光条件下反应，且衍生完成后需立即进样分析，易生成多级衍生物
AQC	加热避光10 min左右	AQC是一种较新兴的衍生试剂，也是近年应用较为广泛的柱前衍生试剂之一，反应迅速。衍生产物既可用紫外检测，检测波长254 nm；也可用荧光检测，激发波长250 nm，发射波长395 nm。该方法具有分离度和灵敏度高、准确度好等优点	衍生试剂不稳定，易与水反应，要在干燥条件下保存，试剂成本高
DNFB	加热避光30 min	衍生产物稳定(4 ℃避光可保存1个月)，在360 nm处有较强吸收，重现性好，灵敏度和准确度高，试剂成本低，易于购买	衍生反应较慢

2.2.2 流动相比例

试验通过改变流动相中乙腈和水的比例进行梯度洗脱，考察了乙腈∶水(体积比，下同)分别为1 ∶4、1 ∶1和2 ∶0对17种氨基酸色谱峰的分离效果，结果见图 3。

图 3

乙腈和水不同体积比的梯度洗脱色谱峰

当乙腈∶水为2 ∶0时，arg-gly-thr、lie-leu、phe和his的分离度＜1，分离效果不理想；当乙腈∶水为1 ∶4时，所有氨基酸均未出峰；当乙腈∶水为1 ∶1时，17种氨基酸的分离效果较好。试验结果表明，乙腈在流动相中的占比起主要作用，当乙腈占比过大时，各氨基酸峰向前漂移，且分离效果不理想；当乙腈占比过小时，会导致所有氨基酸均不出峰。试验选择梯度洗脱的流动相比例见表 1。

2.2.3 衍生温度

衍生温度对测定结果的影响见图 4。

图 4

不同温度衍生的结果变化

从图 4可看出：当衍生温度为55~65 ℃时，衍生结果较稳定；当衍生温度为20~55 ℃时，衍生结果呈上升趋势；当衍生温度为65~80 ℃时，衍生结果明显偏高。这说明在低温条件下，游离氨基酸衍生不完全；而在较高温度下，衍生试剂易挥发，导致衍生结果明显偏高。试验选择衍生温度为60 ℃。

2.2.4 衍生时间

设置衍生时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45 min，测试结果见图 5。

图 5

不同衍生时间的结果变化

从图 5可看出：衍生时间为5~25 min时，衍生结果呈上升趋势，这表明当衍生时间短于25 min时，衍生不完全，结果偏低；衍生时间为25~ 35 min时，衍生结果波动较小；衍生时间为35~ 45 min时，衍生结果呈上升趋势。研究表明，在衍生时间为30 min时，样品已衍生完全；衍生时间为35~45 min时，衍生试剂因时间过长而挥发，导致结果偏高。试验选择衍生时间为30 min。

2.2.5 线性关系和检出限

将17种氨基酸标准物质分别配制成1、2、5、10、50、100、200 μg/mL系列标准溶液，按照试验条件，上机测定。以各氨基酸的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算截距、斜率和相关系数，结果见表 4。从表 4可看出，17种氨基酸的线性关系均良好，决定系数R²均≥0.996 0。

表 4

17种氨基酸的标准曲线、决定系数及检出限

组分	标准曲线	决定系数/R²	检出限/ (mg·kg^-1)
asp	y=2 909.3x-1 094.8	0.999 8	1
glu	y=2 910.2x-133.5	0.999 1	2
ser	y=2 679.9x+1 905.6	0.999 5	1
arg	y=2 560.1x+1 405.6	0.999 4	3
gly	y=2 828.2x-105.6	0.999 1	3
thr	y=2 923.4x-1 071.1	0.999 6	2
pro	y=2 879.9x+1 351.1	0.999 4	1
ala	y=2 708.9x-109.8	0.999 7	3
val	y=2 708.8x-101.1	0.999 7	2
met	y=2 979.4x+1 000.1	0.999 4	1
cys	y=2 901.6x-100.8	0.999 5	3
lie	y=2 987.1x+1 121.7	0.996 0	1
leu	y=2 888.2x-145.8	0.999 5	2
phe	y=2 919.2x+1 114.5	0.999 5	1
his	y=2 897.7x-141.8	0.999 2	1
lys	y=2 906.3x+1 001.8	0.999 4	2
tyr	y=2 945.5x+1 201.1	0.999 5	1

选取空白样品，添加不同质量浓度的17种氨基酸混合标准溶液，按照本研究方法处理，以目标物的信噪比不低于3视为检出限，测得17种氨基酸的检出限见表 4，均满足国家标准的限量要求。

2.2.6 精密度试验

取试样溶液1份，按试验方法中的要求，重复进样6次，观察各组分的分离情况，结果见表 5。从表 5可看出，游离氨基酸各组分测定值的相对标准偏差(RSD)小于2.5%，表明该方法测定游离氨基酸含量具有较好的重现性。

表 5

精密度试验结果

项目	测定值w/%						平均值w/%	RSD/%
项目	1	2	3	4	5	6	平均值w/%	RSD/%
asp	0.81	0.82	0.83	0.80	0.79	0.78	0.80	2.32
glu	1.84	1.85	1.87	1.80	1.79	1.77	1.82	2.14
ser	1.35	1.35	1.36	1.33	1.31	1.30	1.33	1.82
arg	1.16	1.16	1.17	1.13	1.12	1.11	1.14	2.39
gly	0.54	0.55	0.55	0.54	0.54	0.53	0.54	1.39
thr	0.99	1.00	1.01	0.97	0.96	0.96	0.98	2.18
pro	1.05	1.06	1.07	1.05	1.04	1.03	1.05	1.35
ala	0.49	0.49	0.49	0.48	0.48	0.48	0.48	1.13
val	0.50	0.50	0.51	0.50	0.49	0.49	0.50	1.51
met	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0
cys	0.19	0.19	0.19	0.19	0.19	0.18	0.19	2.17
lie	0.21	0.21	0.21	0.20	0.21	0.21	0.21	1.96
leu	0.47	0.47	0.47	0.47	0.46	0.46	0.47	1.11
phe	0.22	0.22	0.23	0.22	0.22	0.22	0.22	1.84
his	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0
lys	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	0.39	0.40	1.02
tyr	0.12	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0
游离氨基酸总量	10.53	10.57	10.66	10.38	10.30	10.21	10.44	1.66

2.2.7 回收率试验

以固态和液态两种含氨基酸水溶肥类的空白样品为基质，依次添加1、5 mg/kg等2种不同质量分数的样品溶液，按照试验方法平行测定6次，结果见表 6。

表 6

回收率试验结果 %

氨基酸	添加量1 mg/kg		添加量5 mg/kg
氨基酸	回收率	RSD	回收率	RSD
asp	98.2	2.1	84.8	0.7
glu	101.2	0.8	98.4	1.0
ser	108.5	2.1	85.8	2.3
arg	98.7	3.0	87.7	4.0
gly	84.5	2.8	86.4	2.1
thr	98.2	4.0	84.5	3.0
pro	99.9	4.5	87.4	2.1
ala	89.7	2.8	83.3	0.8
val	105.4	2.9	89.8	3.2
met	101.2	3.5	107.5	1.0
cys	100.8	2.6	102.5	2.8
lie	98.2	3.2	100.1	4.2
leu	86.5	2.9	98.2	3.0
phe	98.7	3.0	100.0	0.7
his	95.6	2.8	87.8	3.1
lys	94.5	3.0	98.2	4.1
tyr	95.6	4.0	99.9	3.2

从表 6可看出，回收率为83.3%~108.5%，RSD为0.7%~4.5%，表明方法的回收率较高，精密度较好。

3 结语

本试验建立了高效液相色谱法测定肥料中游离氨基酸的含量，氨基酸目标物的质量浓度在1~200 μg/mL范围内线性关系良好，决定系数R²均＞0.996 0，检出限为1~3 mg/kg，17种氨基酸的加标回收率为83.3%~108.5%。在优化的试验条件下进行精密度试验，测定值的RSD小于2.5%。与氨基酸自动分析仪法的测定结果进行对比，差值均＜1.0%。优化后的方法衍生物稳定、操作简单、准确度高、重现性好，适用于肥料中游离氨基酸的测定。

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