Effects of Different Microbial Agents on the Yield and Quality of Chinese Materia Medica <i>Salvia miltiorrhiza</i>
摘要:
为考察不同微生物菌剂对丹参产量和品质的影响,开展了田间小区试验。试验在健康丹参中筛选出具有较好促生效果的链霉菌和假单胞菌制成菌液,共设置不添加菌剂(CK)、添加链霉菌菌剂(T1)和添加假单胞菌菌剂(T2)等3个处理,考察了不同处理的单参产量、丹参中脂溶性与水溶性成分含量以及丹参农艺性状等指标。结果表明:与CK处理相比,添加菌剂处理的丹参产量均有所提升,T2、T1处理分别增产32.52%、24.39%;T1、T2处理对丹参的株高有明显的促进作用,T1处理对丹参的叶长有显著的提升效果;T2处理显著提升了丹参酮Ⅰ的含量,T1、T2处理的丹参新酮含量显著高于CK处理的。添加链霉菌菌剂和假单胞菌菌剂对丹参的产量和品质均具有促进作用。
Abstract:
A field plot experiment is conducted to investigate the effects of different microbial agents on the yield and quality of Salvia miltiorrhiza. Streptomyces and Pseudomonas strains with good growth-promoting effects are screened from healthy Salvia miltiorrhiza plants and prepared into bacterial suspensions. The experiment includes three treatments: no microbial agent application (CK), application of the Streptomyces agent (T1), and application of the Pseudomonas agent (T2). Indicators such as the yield, the content of liposoluble and water-soluble components in Salvia miltiorrhiza, and its agronomic characters are examined under different treatments. The results show that compared with the CK treatment, the microbial agent treatments increase the yield of Salvia miltiorrhiza, with T2 and T1 treatments increasing the yield by 32.52% and 24.39%, respectively. Both T1 and T2 treatments significantly promote the plant height of Salvia miltiorrhiza, and the T1 treatment significantly increases the leaf length. The T2 treatment significantly increases the content of tanshinone Ⅰ. The contents of miltirone in the T1 and T2 treatments is significantly higher than these in the CK treatment. The application of Streptomyces and Pseudomonas agents promotes the yield and quality of Salvia miltiorrhiza.
0
前言
丹参为唇形科鼠尾草属药用植物,其干燥的根茎具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[1]。在临床上,丹参常用于治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、再灌注损伤、心肌缺血、心律失常等疾病[2]。在《神农本草经》中,丹参被列为上品:“味苦微寒,主心腹邪气,肠鸣幽幽如走水,寒热积聚,破症除瘕,止烦满,益气”。现代研究表明,丹参中含有的亲脂性成分(丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮等)和亲水性成分(丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸Y等)对心血管具有保护作用,且这些成分间存在潜在的协同作用[2-5]。
随着我国中医药产业的蓬勃发展,中药材的需求日益增多,栽培面积不断扩大[6]。丹参作为一种重要的中药材,在我国中医药行业中具有重要地位。目前,丹参主要产地为四川、山东、河南、陕西和安徽等省。但在规模化栽培发展过程中,大量不科学地施用化肥、农药等措施,对产地生态环境以及药材品质产生了极大的影响[7]。为改变这种状况,生物肥料可作为化肥的有效补充。生物肥料的菌种通常由各种有益细菌、真菌和藻类组成,如根瘤菌、芽孢杆菌、乳酸菌、假单胞菌、酵母和放线菌等[8-10]。有益微生物制剂可以通过提高土壤肥力和调节根际微生物群落多样性来影响宿主的生物量和质量。微生物肥料因具有营养全面、肥效持久的特点及可修复土壤、增强植物抗逆能力等功能,在推动农业绿色发展方面发挥了重要的作用[11-12]。假单胞菌属细菌能在根际土壤中定殖,可抑制土传病害的发生,并促进不同作物的生长[13]。链霉菌可产生多种抗生素、植物激素等活性物质,对提高植物的抗病性能具有重要的作用[14]。有研究表明,链霉菌能促使土壤中弱势的有益真菌、原生动物、假单胞菌属和链霉菌属细菌等功能菌群的生长,具有改善土壤肥力和促进土壤养分转化的作用[15]。前人研究证明,链霉菌和假单胞菌在粮食作物和蔬菜生长过程中具有促生和抗病作用,但有关利用其研制的微生物菌剂在中药材丹参生产中的应用研究较少,特别是对丹参品质的影响鲜有报道。
本文利用田间小区试验,分别研究了假单胞菌和链霉菌菌剂对丹参中脂溶性与水溶性活性成分、农艺性状及产量的影响,以期为我国中药材产业中丹参的生态种植和科学施肥制度的建立提供依据。
1
材料与方法
1.1
试验地及概况
试验于2023年4月至10月在江苏省南京市蔬菜花卉科学研究所(31°72′ N,118°77′ E)的设施蔬菜大棚进行。该区域年平均气温15.4 ℃,年平均降雨量为1 106 mm。供试田块于2015年9月至2022年12月期间连续施用有机肥,共15季,每季施肥量为6 000 kg/hm2。
供试土壤基本理化性状:pH为6.92,w(有机质)为14.27 g/kg,w(全氮)为1.33 g/kg,w(全磷)为0.91 g/kg,w(全钾)为10.23 g/kg,w(有效磷)为39.56 mg/kg,w(速效钾)为51.45 mg/kg。
1.2
供试材料
供试作物:丹参,品种为“紫花丹参”,种子购于山东省潍坊市潍城区西关绿汌苗木销售中心。
供试菌株:本实验室从健壮丹参根际或根内分离出的假单胞菌C145和链霉菌B136。
供试肥料:猪粪有机肥,w(总氮)为23.92 g/kg,w(总磷)为33.38 g/kg,w(总钾)为24.06 g/kg,施用量为6 000 kg/hm2,由江苏省连云港亚丰农业发展有限公司提供。参考常规化肥处理施肥量,按总氮(N)、总磷(P2O5)、总钾(K2O)各150 kg/hm2的底肥施用量,在小区中施入尿素、过磷酸钙和硫酸钾,以调整养分含量。
1.3
试验设计
试验共设置3个处理:对照(CK)处理,不加菌剂;T1,施用链霉菌B136菌剂;T2,施用假单胞菌C145菌剂。猪粪有机肥作为所有处理的底肥;在丹参定植后的30 d和45 d,分两次接种菌剂,接种浓度均为108 CFU/mL,接种量为每株丹参100 mL。每个处理设置3个重复,按照随机区组原则排列。每个小区长3 m、宽1.8 m,面积为5.4 m2。
将假单胞菌C145和链霉菌B136分别用胰蛋白胨大豆肉汤培养基培养1 d,经过发酵后获得相应的细菌发酵液。各细菌发酵液经转速9 000 r/min离心分离10 min,弃去上清液,加无菌水重悬,重悬后的菌液即为试验所用的菌剂。基肥施肥一周后,在各小区内按25 cm×30 cm的间距挖窝,深度为10 cm左右,每窝栽2株丹参苗,覆土浇水露苗头。丹参生长期间需及时除草和杀虫。6个月后,采集丹参的地下部供测定。
1.4
测定项目
1.4.1
丹参植株农艺参数
丹参移栽后4个月,测定丹参植株株高、叶长、叶宽和叶绿素相对含量(SPAD值)。株高为丹参基部到最上部展开叶叶尖的距离,叶长和叶宽为丹参植株顶端展开叶的长度和宽度,均使用直尺测量。每个小区随机选取丹参植株3株,使用SPAD-502型便携式叶绿素仪(日本Minolta公司)测定丹参主茎叶片的SPAD值。叶面积计算公式:叶面积=叶长×叶宽×0.75。
1.4.2
丹参产量
丹参成熟后,每小区收获全部丹参地下部,称量鲜质量作为产量指标。
1.4.3
丹参有效成分
每个小区随机取10棵丹参植株的地下部,根部用清水快速冲洗去泥后自然风干,然后用球磨仪打磨成粉。
丹参中的有效成分分为以酚酸为代表的亲水性成分和以丹参酮类为代表的亲脂性成分,其中:水溶性成分包括原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸Y;脂溶性成分包括隐丹参酮、丹参新酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。水溶性和脂溶性有效成分的含量委托中医科学院中药资源中心进行测定。
试验采用超高效液相色谱(UPLC)及超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术(UPLC-QQQ-MS)测定丹参药用成分的含量。供试样品的制备参照《中华人民共和国药典:2020》[1]丹参项下对丹参酚酸类及丹参酮类的提取方法,精密称取干燥细粉(过四号筛)0.015 g,置于2 mL EP管中,精密加入纯甲醇(丹参酮类提取溶剂)或80%甲醇(酚酸类提取溶剂)1.5 mL,称量质量,超声提取(功率300 W,频率40 kHz)40 min;冷却后再称量质量,用提取溶剂补足失重。以转速12 000 r/min离心分离5 min,上清液过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,上机测定。试验选用王巧等[16]推荐的质谱条件和色谱条件进行测定。
1.5
数据分析
试验数据采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)不同处理之间的方差,运用GraphPad Prism 10.1.2软件进行数据分析和绘图。
2
结果与分析
2.1
不同处理对丹参农艺性状的影响
不同处理的丹参主要生长指标见表 1,表中同列数据后不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05),下同。
表 1
|
处理 |
SPAD值 |
株高/cm |
叶长/cm |
叶宽/cm |
叶面积/cm2 |
|
CK |
43.10±3.55 a |
44.78±2.20 b |
10.13±1.32 b |
6.76±0.89 a |
51.88±12.62 a |
|
T1 |
45.03±1.67 a |
48.58±2.45 a |
11.96±0.69 a |
7.12±1.05 a |
64.14±10.46 a |
|
T2 |
41.73±1.44 a |
47.17±2.00 a |
11.02±0.36 ab |
7.62±1.10 a |
63.07±10.93 a |
从表 1可看出,T1处理的SPAD值最大,较CK处理的提升了4.48%。T1处理的株高最高,较CK处理的显著提升8.49%;T2处理的株高次之,较CK处理的显著提升5.34%。T1处理的叶长最长,较CK处理的显著提升18.07%;T2处理的叶长较CK处理的提升8.79%。T2处理的叶宽最宽,较CK处理的提升12.72%;T1处理的叶宽较CK处理的提升5.33%。T1处理的叶面积最大,较CK处理的提升23.63%;T2处理的叶面积较CK处理的提升21.57%。结果表明,添加有益微生物对丹参的农艺性状具有促进作用。
2.2
不同处理对丹参产量的影响
不同处理的丹参产量见图 1,图中不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05),下同。
图 1
从图 1可看出:T2处理的产量最高,为1 342.23 kg/亩(1亩=667 m2),较CK处理的显著增产329.38 kg/亩;T1处理的产量次之,为1 259.89 kg/亩,较CK处理的增产247.04 kg/亩。结果表明,添加有益微生物能够提高丹参产量。
2.3
不同处理对丹参有效成分总含量的影响
不同处理的丹参有效成分总含量见表 2。
表 2
|
处理 |
w(脂溶性成分) |
w(水溶性成分) |
w(脂溶性成分+ 水溶性成分) |
|
CK |
5.12±0.54 a |
24.24±3.27 a |
29.36±2.75 a |
|
T1 |
8.14±3.69 a |
22.10±13.50 a |
30.24±17.18 a |
|
T2 |
8.59±2.85 a |
29.53±2.20 a |
38.12±1.06 a |
从表 2可看出,不同处理对酮类脂溶性和酚酸类水溶性成分的总含量产生不同的影响。T2处理的脂溶性成分总含量最高,较CK处理的提升67.77%;T1处理的次之,较CK处理的提升58.98%。T2处理的水溶性成分总含量最高,较CK处理的提升21.82%。T2处理的脂溶性成分+水溶性成分总含量最高,较CK处理的提升29.84%;T1处理的次之,较CK处理的提升3.00%。以上结果表明,添加有益微生物能促进丹参中有效成分的积累。
2.4
不同处理对丹参水溶性成分的影响
不同处理的丹参水溶性成分含量见图 2。
图 2
从图 2可看出:T1处理的丹酚酸A积累量最高,较CK处理的提升51.69%;T2处理的次之,较CK处理的提高30.89%。T2处理的丹酚酸B积累量最高,较CK处理的提高36.13%。在丹酚酸Y、咖啡酸、原儿茶醛等成分方面,CK处理表现出较好的积累效果。以上结果表明,添加有益微生物对丹参水溶性成分积累的影响差异不大,链霉菌处理下丹酚酸A的含量最高,假单胞菌促进了丹酚酸B的积累。
2.5
不同处理对丹参脂溶性成分的影响
不同处理的丹参脂溶性成分含量见图 3。
图 3
从图 3可看出:T2处理的丹参酮Ⅰ含量最高,为2.78 mg/g,较CK处理的显著提升86.58%;T1处理的次之,为1.80 mg/g,较CK处理的提升20.83%。T1处理的隐丹参酮含量最高,为3.118 mg/g,较CK处理的提升536.05%;T2处理的次之,为2.240 mg/g,较CK处理的提升357.82%。T1处理的二氢丹参酮Ⅰ含量最高,为0.056 mg/g,较CK处理的提升301.47%;T2处理的次之,为0.026 mg/g,较CK处理的提升94.89%。T2处理的丹参酮ⅡA含量最高,为2.71 mg/g,较CK处理的提升4.63%。T1处理的丹参新酮含量最高,为1.09 mg/g,较CK处理的显著提升106.15%;T2处理的次之,为0.84 mg/g,较CK处理的显著提升57.79%。结果表明,添加有益微生物能促进丹参脂溶性成分的积累。
3
讨论
试验中2种微生物菌剂处理相对于CK处理均表现出产量提升,其中T2处理的产量提升幅度显著。有研究表明,增施荧光假单胞菌更有利于油菜等作物对养分的吸收利用,提高油菜的产量、品质及氮肥利用率[17];荧光假单胞菌剂处理可提高2个青贮玉米品种的产量[18]。还有研究表明,娄彻氏链霉菌可促进温室草莓植株地上部和地下部的生长,提高果实产量与品质,改善土壤化学特性,重塑根际土壤微生物群落结构[19]。Wei等[20]的研究发现,链霉菌能显著促进小麦植株的生长。采用由枯草芽孢杆菌、滋养节杆菌、根瘤菌和中华根瘤菌组成的复合菌剂拌种,能显著促进黄芪生长,增加株高、根长、根茎和根干质量[21]。从太子参根际土壤分离筛选得到的促生菌解淀粉芽孢杆菌,能够促进太子参株高、平均叶面积和块根生物量的增加[22]。这与试验结果一致,施用微生物菌剂处理的丹参产量高于单施有机肥处理的,表明微生物菌剂的添加促进了丹参产量的提升。
农艺性状和经济性状是影响作物产量的重要因素,也是衡量施肥效果的重要指标[23]。丹参地上部的农艺性状反映了丹参地下部的质量。有研究表明,施用微生物菌肥后,可以提升连作川丹参的生物量,对地上部鲜质量、根鲜质量、地上部干质量和根干质量都有促进作用[24]。接种有益微生物以及中药渣与有益微生物联用处理,均能促进栽培丹参的生长,提高栽培丹参的质量[25]。这与试验结果一致,施加微生物菌剂处理的丹参,其株高、叶面积等农艺性状都优于单施有机肥处理的。与CK处理相比,T1、T2处理显著提高了丹参的株高,T1处理的叶长比CK处理的有显著提升。结果表明,有益微生物促进了丹参地上部的发育,为后期有效物质的积累创造了有利条件,从而带动地下部有效物质的积累。
中药材生产在追求产量的同时,更应注重药用成分的稳定与质量的提升。在试验中,接种微生物菌剂对丹参水溶性成分的积累影响不大,T2处理的丹酚酸B积累量最高,T1处理的丹酚酸A积累量最高。接种微生物菌剂有益于丹参脂溶性成分的积累。有研究表明,白芷根际促生菌克雷伯氏菌株能够显著增加欧前胡素和异欧前胡素总成分的含量[26]。微生物菌肥通过增加根际有益微生物的生物量,进而提高中药材的产量和品质[27],这一点已在对重楼[28]、生姜[29]等的研究中得到了证实。微生物菌剂对不同中药材的药用成分的积累存在差异,如假单胞菌能提高当归的阿魏酸含量[30],丛枝菌根真菌和芽孢杆菌能提高穿心莲的萜类化合物的含量[31]。在有机肥中添加微生物可以促进丹参的总丹参酮和丹酚酸B含量的提升,从而提高丹参中的药用成分含量[32]。这与试验结果一致,添加有益微生物能促进丹参中有效成分的积累,对丹参的脂溶性成分有不同程度的提升作用,促进了丹参对脂溶性成分的积累。
综上所述,施加微生物菌剂对丹参的产量和品质具有促进作用。T2处理对提高丹参产量的效果最好,T1处理的次之。在丹参的农艺性状方面,微生物菌剂对丹参的株高、叶面积的增长具有促进作用,其中T1处理的效果较好。在丹参的有效成分中,微生物菌剂对丹参中脂溶性成分的积累具有促进作用且表现稳定;在水溶性成分中,T1处理促进了丹酚酸A的积累,T2处理促进了丹酚酸B的积累。因此,施加微生物菌剂对丹参的产量和品质均具有促进作用。
4
结语
在丹参的种植过程中,施加微生物菌剂对丹参的生长量、生物量和药用成分含量等均有一定的提升效果,因此可将微生物菌剂用于优质丹参的培育。不同种类的微生物菌肥及施用量对丹参生长效果的影响不同。本试验结果表明,添加两种菌剂后,丹参产量分别增加32.52%和24.39%;T1、T2处理的丹参株高,T1处理的丹参叶长及丹参新酮含量,T2处理的丹参酮Ⅰ含量均显著高于CK处理的,试验结果可为微生物菌剂在丹参培育中的应用提供参考。