肥料中鱼蛋白肽含量测定方法的研究

Research on Determination Method of Fish Protein Peptide Content in Fertilizers

doi: 10.3969/j.issn.2096-7047.2026.06.012

宋海妹 Haimei SONG , 刁红霞 Hongxia DIAO , 张超一 Chaoyi ZHANG , 台文静 Wenjing TAI , 张静 Jing ZHANG , 王程程 Chengcheng WANG , 雷芳 Fang LEI

青岛海大生物集团股份有限公司山东青岛 266000 Qingdao Seawin Biotech Group Co., Ltd., Qingdao, Shandong 266000, China

摘要：

建立了三氯乙酸-双缩脲分光光度法测定肥料中鱼蛋白肽含量的方法。肥料样品用体积分数15%的三氯乙酸溶液预处理30 min后，采用紫外-可见分光光度计于540 nm处测定溶液的吸光度。结果表明：在0~1.0 mg/mL范围内，鱼蛋白肽质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，R²=0.999 4；方法的加标回收率为95.0%~104.8%，10次平行测定结果的相对标准偏差为1.99%。三氯乙酸-双缩脲分光光度法具有良好的精密度与准确度，适用于肥料中鱼蛋白肽含量的测定。

关键词：

肥料; 鱼蛋白肽; 三氯乙酸-双缩脲; 分光光度法;

Abstract：

A trichloroacetic acid-biuret spectrophotometry is established for the determination of fish protein peptide content in fertilizers. After pre-treating the fertilizer sample with 15% (volume fraction) trichloroacetic acid solution for 30 min, the absorbance of the solution is measured at 540 nm using ultraviolet-visible spectrophotometre. The results show that the fish protein peptide mass concentration exhibited a good linear relationship with absorbance within the range of 0-1.0 mg/mL, with R²=0.999 4. The spiked recovery rate of the method is 95.0% to 104.8%, and the relative standard deviation of the result from 10 parallel determinations is 1.99%. The trichloroacetic acid-biuret spectrophotometry offers good precision and accuracy, making it suitable for the determination of fish protein peptide content in fertilizers.

Keyword：

fertilizer; fish protein peptide; trichloroacetic acid-biuret; spectrophotometry;

鱼蛋白肽是复杂的有机混合物，富含小分子多肽、氨基酸等多种活性物质，可被作物直接吸收并参与蛋白质、核酸及内源激素的合成^[1]，同时具有增强植物抗逆性和抗病能力的显著效果^[2-3]，因此含有鱼蛋白肽的肥料作为一种无公害的新型环保肥，在农业生产领域正逐步发挥其作用^[4-7]。然而，该产品的推广受到分析检测技术不完善的制约，主要原因在于鱼蛋白肽组成复杂、组分多样，且现有的分离与检测技术存在局限性。目前，肥料中鱼蛋白肽的检测主要采用蛋白质分析法^[8]和氨基酸分析法^[9]。蛋白质分析法易受到肥料中无机氮、氨基酸及其他含氮添加剂(如尿素、三聚氰胺等)的干扰，导致总氮测定结果偏高^[10]。氨基酸分析法通过计算总氨基酸与游离氨基酸的差值间接获得肽含量，虽可基于氨基酸组成进行一定程度的特异性鉴别，但在实际检测中，大分子蛋白质(或肽段)也被水解成氨基酸，导致总氨基酸含量升高，从而造成鱼蛋白肽测定结果偏高^[11]；此外，该方法操作复杂、设备昂贵，难以在常规检测中推广应用。

针对上述方法在特异性、准确度和实用性方面的不足，本研究参考行业标准《乳与乳制品中蛋白质的测定双缩脲比色法》(NY/T 1678—2008)，对利用双缩脲比色法测定蛋白质含量的方法进行改良，发布了企业标准《鱼蛋白肽含量的测定》(Q/370202WXS 036-2022)。方法原理：以三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂^[12]，通过选择性沉淀去除样品中的蛋白质与长链多肽，滤液中保留了短链小肽组分；小肽含有肽键，在碱性溶液中加入双缩脲试剂(含Cu²⁺)形成紫红色络合物，其颜色深浅与小肽含量成正比；于540 nm波长处进行比色测定，对溶液中短链小肽进行定量分析。本研究旨在建立一种准确、可靠的检测方法，为含鱼蛋白肽肥料的质量控制与推广应用提供技术支持。

1 主要仪器和试剂

1.1 主要仪器

普析TU-1810型紫外-可见分光光度计，配1 cm比色皿，北京普析通用仪器有限责任公司；25 mL具塞试管，常德比克曼生物科技有限公司；HH-4型恒温水浴锅，国华(常州)仪器制造有限公司；移液枪，0.1~1 mL，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司。

1.2 主要试剂

5 mg/mL牛血清蛋白标准溶液：准确称取0.5 g牛血清蛋白，用蒸馏水溶解定容至100 mL，贮存于4 ℃冰箱。双缩脲试剂：准确称量1.5 g五水硫酸铜(分析纯)和6 g酒石酸钾钠(分析纯)，用500 mL水溶解，在搅拌下加入100 g/L的氢氧化钠(分析纯)溶液300 mL，用水稀释至1 L，贮存于塑料瓶中。三氯乙酸(TCA)溶液：准确吸取15 mL TCA，用蒸馏水溶解定容至100 mL。以上所用试剂厂家均为国药集团化学试剂有限公司。

2 分析步骤

2.1 试样溶液的制备

取样前混匀或者摇匀肥料样品，准确称取1.0 g样品，加入15%(体积分数，下同)TCA溶液10 mL，震荡混匀，用水定容至50 mL，静置5 min，将大分子蛋白质(或肽段)过滤，取滤液备用。

2.2 建立标准工作曲线

取12支试管，分为两组，用移液枪分别准确吸取5 mg/mL牛血清蛋白标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用水补足至1 mL，分别加入4 mL双缩脲试剂，配制成牛血清蛋白质量浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的系列标准溶液。

以空白溶液为参比，于540 nm处测定系列标准溶液的吸光度。以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，两组测定的吸光度平均值为纵坐标，绘制标准曲线。经线性回归分析，得到标准曲线方程为y=0.267 6x+0.003 4(y为吸光度，x为牛血清蛋白质量浓度)，决定系数R²=0.999 4。标准曲线显色机理为肽键显色，牛血清蛋白、肽均是通过肽键连接，显色原理一致，故使用牛血清蛋白作为标准品，标准曲线既是蛋白质标准曲线，又是本文中的小肽标准曲线。标准曲线试验数据见表 1。

表 1

标准曲线试验数据

ρ(牛血清蛋白)/(mg·mL^-1)	吸光度平均值	吸光度标准偏差
0
0.2	0.059	0.141
0.4	0.112	0.283
0.6	0.165	0.849
0.8	0.219	0.990
1.0	0.268	0.141

2.3 测定及结果计算

按系列标准溶液工作条件测定样品的吸光度，根据线性回归方程得到肥料中鱼蛋白肽的含量。

固体试样中鱼蛋白肽含量以质量分数(%)计，按式(1)计算：

图 1

$ w=\frac{c \times V_1}{m_1 \times 1\;000} \times 100 \% $

液体试样中鱼蛋白肽含量以质量浓度(g/L)计，按式(2)计算：

图 2

$ w=\frac{c \times V_1}{m_1 \times 1\;000} \times 100 \% $

式中：c——由标准曲线查得的试样溶液中鱼蛋白肽的质量浓度，mg/mL；

V₁——取样时的定容体积，mL；

m₁——取样质量，g；

ρ_样品——样品液体密度，按照行业标准《液体肥料密度的测定》(NY/T 887—2010)中的方法测定，g/mL。

3 结果与分析

3.1 方法的精密度

按照已建立的标准曲线测定方法和试验条件，在同一批次内对已知鱼蛋白肽质量分数为8%的肥料样品进行10次重复测定，结果见表 2。

表 2

鱼蛋白肽测定结果

测定次数	吸光度	ρ(鱼蛋白肽)/(mg·mL^-1)	w(鱼蛋白肽)/%
1	0.089	0.320	8.000
2	0.090	0.324	8.095
3	0.092	0.331	8.280
4	0.086	0.309	7.720
5	0.088	0.316	7.905
6	0.089	0.320	8.000
7	0.088	0.316	7.905
8	0.088	0.316	7.905
9	0.089	0.320	8.000
10	0.091	0.327	8.185

结果表明，10次测定得到鱼蛋白肽质量分数的平均值为7.999 5%，标准偏差为15.89%，相对标准偏差(RSD)为1.99%。这说明基于三氯乙酸-双缩脲分光光度法测定水溶肥料中鱼蛋白肽含量的方法精密度较高。

3.2 方法的准确度

3.2.1 标准物质含量测定

以质量浓度为0.4 mg/mL的牛血清蛋白标准物质为例进行6次重复测定，结果见表 3。

表 3

标准物质测定结果

测定次数	吸光度	ρ(牛血清蛋白)/(mg·mL^-1)
1	0.109	0.395
2	0.108	0.391
3	0.110	0.398
4	0.112	0.406
5	0.109	0.395
6	0.109	0.395

从表 3可看出，标准物质牛血清蛋白测定结果的平均值为0.397 mg/mL(n=6)，相对误差为-0.75%。这说明本方法具有良好的准确度，为后续样品加标回收试验提供了可靠性依据。

3.2.2 加标回收试验

对已知质量分数为8%的样品进行加标回收试验，结果见表 4。从表 4可看出，加标回收率为95.0%~104.8%，平均回收率为100.8%，表明采用本方法进行鱼蛋白肽含量分析，准确度高，数据可靠。

表 4

方法准确度试验结果

测定次数	样品本底量/mg	加标量/mg	实测总量/mg	回收率/%	平均回收率/%
1	1.600	2	3.615	100.8	100.8
2	1.619	2	3.667	102.4
3	1.656	2	3.556	95.0
4	1.544	2	3.639	104.8
5	1.581	2	3.596	100.8
6	1.600	2	3.616	100.8
7	1.581	2	3.595	100.7
8	1.581	2	3.613	101.6
9	1.600	2	3.616	100.8
10	1.637	2	3.650	100.6

4 结语

本研究基于企业标准Q/370202WXS 036—2022建立的三氯乙酸-双缩脲分光光度法，测定肥料中鱼蛋白肽含量并进行了方法学验证。在预处理前期，三氯乙酸将肥料中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，而短链小肽保留在溶液中，基于此对肥料中的鱼蛋白肽进行定量分析。结果表明，该方法的精密度和准确度均较高，RSD为1.99%，平均回收率为100.8%，重复性和稳定性良好。因此，本方法适用于测定肥料中的鱼蛋白肽含量，可为鱼蛋白肽在农业领域应用时的质量监控提供切实可行的技术依据。

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