Determination of <i>γ</i>-Aminobutyric Acid Content in Water-Soluble Fertilizers by High-Performance Liquid Chromatography
摘要：
建立了高效液相色谱法测定水溶肥料中γ-氨基丁酸含量的方法。称取约含0.025 g γ-氨基丁酸的水溶肥料样品，用水定容至100 mL；精确量取1.00 mL溶液，加入0.50 mL衍生缓冲溶液和1.00 mL衍生试剂溶液，混合后置于60 ℃的水浴中加热1 h，冷却至室温后加水定容至10 mL并混匀，用0.22 μm的滤膜对溶液进行过滤，采用C18色谱柱，在高效液相色谱条件下，外标法测定样品中γ-氨基丁酸的含量。结果表明：方法的检出限为0.01 μg/mL，定量限为0.04 μg/mL，相对标准偏差为1.19%~2.96%，加标回收率为98.7%~100.2%。方法重复性好、准确可靠，可以准确测定水溶肥料中γ-氨基丁酸的含量。
Abstract：
A high-performance liquid chromatography (HPLC) is developed for the determination of γ-aminobutyric acid in water-soluble fertilizers. A water-soluble fertilizer sample containing about 0.025 g of γ-aminobutyric acid is weighed and diluted to 100 mL with water. A 1.00 mL aliquot of the solution is mixed with 0.50 mL of derivatization buffer solution and 1.00 mL of derivatization reagent solution. The mixture is heated at 60 ℃ for 1 h in a water bath, cooled to room temperature, diluted to 10 mL with water, and homogenized. The solution is filtered through a 0.22 μm membrane filter and analyzed using a C18 column under HPLC conditions, and the content of γ-aminobutyric acid is quantified by the external standard method. The results demonstrate a limit of detection of 0.01 μg/mL, a limit of quantification of 0.04 μg/mL, relative standard deviations ranging from 1.19% to 2.96%, and spike recovery rates between 98.7% and 100.2%. The method shows good repeatability, accuracy, and reliability, and can be used for the precise determination of γ-aminobutyric acid in water-soluble fertilizers.
γ-氨基丁酸在水溶肥料中的应用范围正逐渐扩大，其独特的生物活性和多功能性为农业生产带来了显著的效益[1]。具体而言，γ-氨基丁酸能提升植物对矿物质(如B、Mg、Ca、K)的吸收[2]，优化营养状态，促进生长；同时，能够改善土壤环境，提高肥力[3]，减少养分流失，提升资源的利用效率[4]。通过叶面喷施，γ-氨基丁酸可快速被植物吸收[5]；与其他肥料混合，能协同增效，提高肥效和作物产量[6]。
目前，γ-氨基丁酸的测定方法主要有比色法[7]、高效液相色谱法[8]和氨基酸分析仪法[9]等，这些方法在实际应用中均存在一定的局限性。比色法易受样品中色素、显色液稳定性及游离氨等因素的影响，导致测定结果的精确性和灵敏度降低[10]；氨基酸分析仪法则因设备价格昂贵、使用费用高以及检测耗时长等缺点，难以在企业中普及应用。高效液相色谱法具有样品消耗量少、测量精确度高等优点，但样品的预处理及衍生化手段的差异也会对测量的精确度与效率产生影响。本文针对水溶肥料的特点，通过不同的条件试验，同时通过方法检出限、精密度和正确度试验，建立了一种适用于测定水溶肥料中γ-氨基丁酸含量的高效液相色谱分析法，以期为水溶肥料产品的质量控制提供参考[11]。
1
试验部分
1.1
试验原理
γ-氨基丁酸与2, 4-二硝基氟苯可发生定量衍生化反应，生成在360 nm波长下有较强紫外吸收的稳定衍生物。多种不同的氨基酸衍生物同时注入色谱柱时，会因其与流动相和固定相之间在溶解、吸附、渗透或离子交换等物理化学作用上的差异，在色谱柱的流动相与固定相间经历多次分配循环，造成各组分在色谱柱内的移动速率不同。经过一定长度的色谱柱后，各组分逐渐相互分离并按一定次序从色谱柱末端流出，经记录仪或数据处理系统形成各自特征性的谱峰，通过这些谱峰的保留时间与已知标准品对比，依据外标法进行精确的定量分析。
1.2
试剂和仪器
1.2.1
试剂
碳酸氢钠，分析纯，广东光华科技股份有限公司；2，4-二硝基氟苯，纯度98%，上海麦克林生化科技股份有限公司；乙酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2.2
试剂配制
衍生缓冲溶液：称取碳酸氢钠4.2 g，用水溶解后定容至100 mL，摇匀，现配现用。
衍生试剂2，4-二硝基氟苯乙腈溶液(1%)：移取2, 4-二硝基氟苯1.0 mL，用乙腈定容至100 mL，摇匀。
流动相：称取三水合乙酸钠6.8 g，用水溶解并稀释至1 000 mL，摇匀，过滤。
1.2.3
标准品
γ-氨酪酸(γ-氨基丁酸)标准品：标准物质编号为CDAA-740462-100mg，纯度99.30%，上海安谱璀世标准技术服务有限公司。
γ-氨基丁酸标准溶液(250 mg/L): 称取γ-氨基丁酸标准品0.025 g置于100 mL容量瓶中，用水溶解后稀释至刻度，摇匀，有效期为1个月。
1.2.4
仪器
Waters 1525型高效液相色谱仪，美国沃特世公司；HH-S8型电热恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司。
1.3
试验方法
1.3.1
试样的制备
在采样和试样的制备过程中，应注意不污染试样。
固体样品经多次缩分后，称取约100 g试样，迅速将其研磨至能完全通过0.50 mm孔径的筛网(若样品潮湿，则先通过1.00 mm筛网处理)，确保混合均匀后，存放于干净且干燥的容器中。对于液体样品，在充分摇匀后，迅速量取约200 mL，置于清洁、干燥的容器中。
1.3.2
样品溶液的制备
称取适量已均质的试样(约含0.025 g γ-氨基丁酸)，用水溶解并定容至100 mL，充分混匀。精确移取1.00 mL试样溶液，置于10 mL容量瓶中。向容量瓶中加入0.50 mL衍生缓冲溶液和1.00 mL衍生试剂溶液，再次混匀。将混合液置于60 ℃的水浴中加热1 h，取出冷却至室温。加水定容至10 mL，并再次混匀。用0.22 μm的滤膜对试样溶液进行过滤，取滤液作为最终的测试溶液。同时做试样空白试验。
1.3.3
标准工作溶液的制备
准确移取250 mg/L γ-氨基丁酸标准溶液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加入0.50 mL衍生缓冲溶液和1.00 mL衍生试剂溶液，充分混匀。将混合液置于60 ℃的水浴中加热1 h，取出冷却至室温后，加水定容至10 mL，并再次混匀。用0.22 μm的滤膜对溶液进行过滤，取滤液作为标准工作溶液备用。
1.4
高效液相色谱仪工作条件
色谱柱：C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙酸钠溶液与乙腈体积比为80∶20；检测波长：360 nm；流量：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
2
结果与讨论
2.1
干扰试验
试验对标准品、样品、大量元素水溶肥(不含γ-氨基丁酸)、中量元素水溶肥(不含γ-氨基丁酸)、含腐殖酸水溶肥(不含γ-氨基丁酸)、空白试剂、样品(不加衍生剂)进行测定，考察干扰γ-氨基丁酸测定的因素，结果见图 1。
图 1
从图 1可看出，空白试剂不干扰样品测定，适用于大量元素、中量元素、含腐殖酸水溶肥料中γ-氨基丁酸的测定。
2.2
称样量的选择
按照试验方法，选择肥料试样(中量元素水溶肥A、大量元素水溶肥B、含腐殖酸水溶肥C)进行称样量试验，结果见表 1。
表 1
|
样品 |
称样量/g |
|
峰面积/(μV·s) |
|
w(γ-氨基丁酸)/% |
|
1 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
|
γ-氨基丁酸标准品 |
0.025 00 |
|
2 430 580 |
|
|
|
|
A |
5.022 4 |
5.021 4 |
|
2 474 161 |
2 443 758 |
|
0.502 |
0.496 |
|
B |
3.066 9 |
3.000 5 |
|
2 590 217 |
2 533 326 |
|
0.861 |
0.861 |
|
C |
2.254 6 |
2.354 1 |
|
2 445 035 |
2 573 396 |
|
1.11 |
1.12 |
试验结果表明，称取的样品应具有代表性，能够反映整体样品的γ-氨基丁酸含量水平。称样量的选择应灵活调整，需要选取不同的称样量以达到最佳的检测灵敏度和准确性。经验证，试样含γ-氨基丁酸约0.025 g时，峰面积能产生足够的信号强度，以确保准确测定并保证数据的可靠性。
2.3
衍生缓冲溶液和衍生试剂溶液用量的选择
称取一定量的中量元素水溶肥A，并向其中分别添加0.25、0.50、1.00 mL的衍生缓冲溶液和0.50、1.00、1.50 mL的衍生试剂溶液，按照试验方法进行测定，结果见表 2。
表 2
|
衍生缓冲溶液/mL |
衍生试剂溶液/mL |
w(γ-氨基丁酸)/% |
相对标准偏差(RSD)/% |
|
测定值 |
平均值 |
|
1 |
2 |
3 |
|
0.25 |
0.50 |
0.386 |
0.380 |
0.385 |
0.384 |
0.81 |
|
0.25 |
1.00 |
0.386 |
0.382 |
0.381 |
0.383 |
0.67 |
|
0.25 |
1.50 |
0.376 |
0.380 |
0.377 |
0.378 |
0.54 |
|
0.50 |
0.50 |
0.469 |
0.463 |
0.471 |
0.468 |
0.90 |
|
0.50 |
1.00 |
0.495 |
0.503 |
0.500 |
0.499 |
0.78 |
|
0.50 |
1.50 |
0.493 |
0.488 |
0.485 |
0.489 |
0.80 |
|
1.00 |
0.50 |
0.469 |
0.466 |
0.466 |
0.467 |
0.36 |
|
1.00 |
1.00 |
0.493 |
0.486 |
0.487 |
0.489 |
0.83 |
|
1.00 |
1.50 |
0.486 |
0.498 |
0.487 |
0.490 |
1.33 |
从表 2可看出，当衍生缓冲溶液用量为0.50 mL，且衍生试剂溶液用量为1.00 mL时，试剂成本较低，且试验效果最佳。
2.4
水浴温度和加热时间的选择
称取中量元素水溶肥A，加入0.50 mL衍生缓冲溶液和1.00 mL衍生试剂溶液，分别在水浴温度为50、60、80 ℃和加热时间为0.5、1.0、1.5 h的条件下，按照试验方法进行测定，结果见表 3。
表 3
|
水浴温度/℃ |
加热时间/h |
w(γ-氨基丁酸)/% |
RSD/% |
|
测定值 |
平均值 |
|
1 |
2 |
3 |
|
50 |
0.5 |
0.233 |
0.238 |
|
0.236 |
1.40 |
|
50 |
1.0 |
0.377 |
0.373 |
0.367 |
0.372 |
1.35 |
|
50 |
1.5 |
0.369 |
0.366 |
0.376 |
0.370 |
1.41 |
|
60 |
0.5 |
0.435 |
0.428 |
0.428 |
0.430 |
0.93 |
|
60 |
1.0 |
0.500 |
0.497 |
0.492 |
0.496 |
0.78 |
|
60 |
1.5 |
0.492 |
0.496 |
0.490 |
0.493 |
0.68 |
|
80 |
0.5 |
0.467 |
0.471 |
0.463 |
0.467 |
0.86 |
|
80 |
1.0 |
0.491 |
0.493 |
0.489 |
0.491 |
0.39 |
|
80 |
1.5 |
0.492 |
0.493 |
0.488 |
0.491 |
0.51 |
从表 3可看出，当水浴温度为60 ℃、水浴加热时间为1.0 h时，既能保证试验结果的精确度和稳定性，又能提升试验效率，同时也能减少能源消耗。
2.5
仪器工作条件的选择
根据仪器使用说明书上的要求调整和优化测试参数。试验采用Waters 1525型高效液相色谱仪，测定γ-氨基丁酸的工作条件见表 4。
表 4
|
色谱柱 |
流动相 |
检测波长/nm |
流量/(mL·min-1) |
柱温/℃ |
进样量/μL |
|
C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm) |
乙酸钠溶液-乙腈(75∶25) |
360 |
1.0 |
30 |
10 |
|
C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm) |
乙酸钠溶液-乙腈(80∶20) |
360 |
1.0 |
30 |
10 |
|
C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm) |
乙酸钠溶液-乙腈(85∶15) |
360 |
1.0 |
30 |
10 |
经验证，γ-氨基丁酸在360 nm波长下，使用流动相为乙酸钠溶液-乙腈(80∶20)的出峰时间最为理想。这一比例不仅确保了γ-氨基丁酸能够顺利从色谱柱中洗脱出来，而且峰形更加清晰、分离度更高，还可以提高测试的准确性和灵敏度。
2.6
方法检出限和定量限
按行业标准《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)附录A的指导原则，空白样品的处理和测定与样品的分析全过程相同，并进行9次平行测定。方法检出限(MDL)按式(1)进行计算：
式中：t——在99%置信水平下、自由度为n-1时的t值(对于9次测定，t=2.896)；
S——9次重复测定的标准偏差。
以4倍检出限作为定量限，试验数据见表 5。
表 5
|
空白测定值 |
平均值 |
标准偏差 |
检出限 |
定量限 |
|
0.049 |
0.060 |
0.050 |
0.051 |
0.051 |
0.051 |
0.004 |
0.01 |
0.04 |
|
0.048 |
0.051 |
0.051 |
0.048 |
|
2.7
精密度试验
按试验方法，对不同γ-氨基丁酸含量的中量元素水溶肥A、大量元素水溶肥B、含腐殖酸水溶肥C进行精密度试验，结果见表 6。
表 6
|
样品 |
测定值w/% |
平均值w/% |
RSD/% |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
中量元素水溶肥A |
0.502 |
0.496 |
0.494 |
0.508 |
0.509 |
0.500 |
0.508 |
0.502 |
1.22 |
|
大量元素水溶肥B |
0.861 |
0.861 |
0.877 |
0.850 |
0.852 |
0.846 |
0.859 |
0.858 |
1.19 |
|
含腐殖酸水溶肥C |
1.11 |
1.12 |
1.09 |
1.03 |
1.09 |
1.08 |
1.12 |
1.09 |
2.96 |
从表 6可看出，γ-氨基丁酸测定值的RSD为1.19%~2.96%，表明所采用的测定方法具有较好的可重复性和稳定性，能够得到精确的测定结果，符合方法精密度的要求。
2.8
准确度试验
按照试验方法，对中量元素水溶肥A、大量元素水溶肥B、含腐殖酸水溶肥C试样进行γ-氨基丁酸的加标回收试验，结果见表 7。
表 7
|
样品 |
本底值m/μg |
加标量m/μg |
测定总量m/μg |
加标回收率/% |
|
中量元素水溶肥A |
12 990 |
12 500 |
25 518 |
100.2 |
|
大量元素水溶肥B |
13 113 |
12 500 |
25 468 |
98.8 |
|
含腐殖酸水溶肥C |
13 425 |
12 500 |
25 765 |
98.7 |
从表 7可看出，水溶肥料样品中γ-氨基丁酸的加标回收率为98.7%~100.2%，呈现出良好的回收效果，进一步证实了方法具有高准确度和可靠性，能满足分析测试的要求。
3
结语
本文采用高效液相色谱法测定水溶肥料中γ-氨基丁酸的含量，并进行了方法验证。
(1) 干扰性评估：空白试剂对样品检测无干扰，方法适用于测定含大量元素、中量元素及腐殖酸的水溶肥料中γ-氨基丁酸的含量。
(2) 灵敏度与定量限：方法的检出限为0.01 μg/mL，定量限为0.04 μg/mL，均符合检测质量要求，表明试验方法具有较高的灵敏度。
(3) 精密度验证：通过对样品进行7次平行测定，所得RSD为1.19%~2.96%，表明试验方法具有良好的精密度、稳定性和重复性。
(4) 准确度验证：进行3个不同γ-氨基丁酸含量样品的加标回收试验，加标回收率为98.7%~100.2%，进一步验证了试验方法的准确性和可靠性，可满足分析需求。
此外，试验还对实验室条件、技术人员能力、仪器设备、标准物质及试剂、样品前处理装置等进行了全面评估，均符合检测要求。综上所述，本文建立的测定水溶肥料中γ-氨基丁酸含量的高效液相色谱法，方法准确可靠，适用于相关产品的质量控制和科学研究。
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